腺病毒介導(dǎo)的CTLA4Ig基因?qū)餐瑢?dǎo)入的其他外源性基因在脊髓表達(dá)的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Adenovirus,AdV)為載體將各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)入脊髓以保護(hù)受損的神經(jīng)元和促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生的研究，己成為神經(jīng)修復(fù)研究領(lǐng)域的前沿課題?；蛑委煹男Ч蕾囉趯⒛康幕蛱禺悺⒏咝Ш桶踩霓D(zhuǎn)染受損神經(jīng)元及神經(jīng)并高效表達(dá)，但由于宿主對(duì)病毒載體的免疫反應(yīng)，使導(dǎo)入的基因不能在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間高水平表達(dá)，從而限制了導(dǎo)入基因的治療作用的發(fā)揮。本實(shí)驗(yàn)將將攜帶LacZ基因的AdV(AdLacZ)與不帶外源基因的．AdO或

2、與攜帶有細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin，CTLA4Ig)基因的AdV(AdCTIA4Ig)通過(guò)微量注射導(dǎo)入大鼠腰膨大脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)，比較共同轉(zhuǎn)染．AdCTIA4Ig后β-半乳糖苷酶(β-gal)在脊髓表達(dá)水平變化；并通過(guò)對(duì)脊髓淋巴細(xì)胞亞群分類染色的觀察、血清抗病毒抗體和中和抗體滴度檢測(cè)，以探討CTLA4Ig對(duì)AdLacZ

3、表達(dá)的影響及其誘導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受的作用和機(jī)理。 方法：選用7周齡健康雌性Wister大鼠160只，體重200～250g。將大鼠隨機(jī)分成兩組，每組80只。對(duì)照組(A組)導(dǎo)入AdlacZ+AdO，實(shí)驗(yàn)組(B組)導(dǎo)入AdlacZ+AdCTIA。將大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻(75-100mg/kg+5mg/kg)，麻醉成功后固定于腦立體定位儀上。取長(zhǎng)約2cm后正中切口，去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-Ⅲ型手動(dòng)

4、推進(jìn)器，于脊髓后正中動(dòng)脈旁開(kāi)0．8mm處注射AdlacZ(1×10<'9>pfu/ml)和AdO(5×10<'9>pfu/ml)各1μl(A組)或AdLacZ(1×10<'9> pfu/ml)和AdCTLA(5×10<'9> pfu/ml)各1μl(B組)。針尖向頭側(cè)呈45度斜行進(jìn)針，斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min，注射完畢后滯針5min，緩慢拔針。充分止血、沖洗傷口，局部噴灑抗生素預(yù)防感染，關(guān)閉傷口。兩組在轉(zhuǎn)染病毒

5、后12個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)鼠尾靜脈取血2ml；在轉(zhuǎn)染后10個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)兩組動(dòng)物脊髓進(jìn)行厚50μm的連續(xù)冰凍橫切片，計(jì)數(shù)A組與B組中5-溴-4-氯-3-吲-口雜-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosideX-gal)染色陽(yáng)性的切片數(shù)，分析比較兩組LacZ基因在脊髓表達(dá)的高峰期和持續(xù)時(shí)間；檢測(cè)血清抗病毒中和抗體滴度；通過(guò)脊髓切片淋巴細(xì)胞亞群分類染色，觀察CD68、CD4和

6、CD8淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS12.0軟件，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間行成組比較t檢驗(yàn)。P值<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:1 共同轉(zhuǎn)染的AdCTIA對(duì)AdLacZ在脊髓表達(dá)的影響：A組在轉(zhuǎn)染后第一天即可觀察到β-gal的表達(dá)，藍(lán)染僅限于細(xì)胞核。轉(zhuǎn)染后第2天胞體和突起逐漸被藍(lán)染，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)逐漸增多。轉(zhuǎn)染的高峰期為2～8天，持續(xù)時(shí)間為2周。B組在轉(zhuǎn)染后第一天即可觀察到β-gal和CTLA4Ig的表達(dá)，轉(zhuǎn)

7、染的高峰期為2～8天，B組的X-gal染色陽(yáng)性表達(dá)時(shí)間約為4周。AdCTIA和AdLacZ基因轉(zhuǎn)染脊髓雙側(cè)的前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞和周?chē)哪z質(zhì)細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因表達(dá)范圍局限于注射點(diǎn)上下各0.6cm區(qū)段，有轉(zhuǎn)基因表達(dá)的陽(yáng)性冰凍橫切片數(shù)≤240片。轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元在注射同側(cè)表達(dá)較對(duì)側(cè)強(qiáng)烈。脊髓陽(yáng)性切片計(jì)數(shù)顯示兩組β-gal在脊髓表達(dá)的高峰期均在2～8天，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩組之間在高峰期間陽(yáng)性切片數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。 2 共同轉(zhuǎn)染的AdCTLA

8、在脊髓對(duì)細(xì)胞免疫的影響： 淋巴細(xì)胞亞群分類染色觀察：A組在病毒導(dǎo)入后24小時(shí)內(nèi)即出現(xiàn)CD68浸潤(rùn)，2天后開(kāi)始出現(xiàn)CD8淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，3天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)極少量CD4淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。病毒導(dǎo)入后6天CD68逐漸消退，免疫反應(yīng)則以CD8淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，伴有極少量CD4細(xì)胞浸潤(rùn)。在轉(zhuǎn)染后第8天CD8細(xì)胞逐漸增多，2周時(shí)達(dá)高峰，其浸潤(rùn)程度較B組嚴(yán)重；持續(xù)到第6周時(shí)仍有少量浸潤(rùn)。B組病毒轉(zhuǎn)染后1～6天，脊髓內(nèi)CD68、CD8和CD4細(xì)胞的浸潤(rùn)程度

9、與A組相似。在轉(zhuǎn)染后第8天CD8細(xì)胞亦逐漸增多，2周達(dá)高峰；持續(xù)到第4周CD4、CD8細(xì)胞基本消退。兩組CD4細(xì)胞8天后均稍有增加但浸潤(rùn)的數(shù)量都很少，并且與CD8消退的時(shí)間基本一致。 3 共同轉(zhuǎn)染的AdCTLA在脊髓對(duì)細(xì)胞免疫的影響： 抗病毒中和抗體滴度測(cè)定：A組轉(zhuǎn)染病毒后第3天血清中可檢測(cè)到抗病毒中和抗體，逐漸增加至第3周達(dá)到高峰并一直穩(wěn)定在這一水平直至第6周。B組在轉(zhuǎn)染后第3天，抗病毒中和抗體同樣也被檢測(cè)出，逐漸增加