MRI評(píng)價(jià)腺病毒介導(dǎo)的酪氨酸酶基因在HepG2細(xì)胞表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 基因治療作為一種新的治療方法，被認(rèn)為是醫(yī)學(xué)科學(xué)中最新、最有潛力和最可能發(fā)生革命性變化的領(lǐng)域。目前，基因治療亟待解決的問(wèn)題是在如何在活體實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)傷地檢測(cè)目的基因的表達(dá)、分布和治療的療效。分子影像學(xué)通過(guò)反映機(jī)體內(nèi)細(xì)胞和分子水平的改變，能夠在活體上對(duì)基因治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，而不影響其生理活動(dòng)，具有遠(yuǎn)大的前景。目前基因表達(dá)顯像應(yīng)用的主要技術(shù)手段包括：核醫(yī)學(xué)、MRI、光學(xué)成像。由于MRI空間分辨率高(已達(dá)μm級(jí))，設(shè)備比較普及

2、，同時(shí)可獲得解剖及生理信息，MRI分子影像學(xué)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。MRI分子影像學(xué)以報(bào)告基因?yàn)榛A(chǔ)，報(bào)告基因即基因的表達(dá)產(chǎn)物能與攜帶影像學(xué)標(biāo)記物的分子探針特異性結(jié)合，從而可為影像學(xué)設(shè)備所檢測(cè)到的基因。其中一個(gè)熱點(diǎn)研究的報(bào)告基因是酪氨酸酶基因，酪氨酸酶是催化合成黑色素的關(guān)鍵酶。黑色素是一種陰離子，能與鐵等金屬高效結(jié)合，降低了金屬回旋的相關(guān)性時(shí)間，使MR的T1弛豫時(shí)間變短，表現(xiàn)為特征性的T1加權(quán)像高信號(hào)。 基因治療的關(guān)鍵技術(shù)是轉(zhuǎn)染，

3、轉(zhuǎn)染需要合適的載體。目前研究用的是非病毒載體，雖然非病毒載體具有簡(jiǎn)便、安全、容量高的優(yōu)點(diǎn)，但轉(zhuǎn)染效率低且缺乏細(xì)胞特異性，應(yīng)用受到限制。為了進(jìn)一步研究酪氨酸酶—黑色素報(bào)告基因系統(tǒng)，我們需要尋找一種高效的載體。由于腺病毒具有許多優(yōu)點(diǎn)，如使用安全，制備容易，能獲得高純度、高滴度的腺病毒載體；以游離型存在，不整合進(jìn)入宿主DNA中，無(wú)遺傳毒性；表達(dá)時(shí)間短暫，一般15-20天，適合—過(guò)性表達(dá)的需要；載導(dǎo)容量相對(duì)較大，理論上可攜帶37kb的DNA；感

4、染宿主范圍較廣，處于靜止期的細(xì)胞也能感染。本研究以酪氨酸酶基因腺病毒重組體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，觀察腺病毒載體運(yùn)送酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)染體外細(xì)胞的效果。 研究目的： 觀察酪氨酸酶基因腺病毒重組體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的效果及黑色素的表達(dá)情況。 1、構(gòu)建酪氨酸酶基因腺病毒重組體。 2、利用酪氨酸酶基因腺病毒重組體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。 3、檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA內(nèi)報(bào)告基因?qū)肭闆r及轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)黑色素表達(dá)情況。

5、4、利用磁共振成像(MRI)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行掃描，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的信號(hào)特征。 材料和方法： 一、酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)染 1、構(gòu)建酪氨酸酶基因腺病毒重組體，委托東方肝膽外科醫(yī)院病毒基因治療室代為合成，pcDNA3tyr質(zhì)粒由美國(guó)哈佛分子影像中心Simonova博士惠贈(zèng)。 2、HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，每2-3天換液一次。采用100mm直徑的一次性培養(yǎng)皿，待細(xì)胞匯合50％約1

6、06個(gè)細(xì)胞且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)使用。 3、轉(zhuǎn)染 細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到106個(gè)時(shí)以無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液換液，在1～4號(hào)培養(yǎng)皿中分別加入空白腺病毒載體及MOI為50、150、300的ad—tyr，作為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后吸去含病毒培養(yǎng)液，PBS輕柔沖洗(2×4 ml)后換以含10％胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)72小時(shí)后以胰酶消化，行后續(xù)檢測(cè)。5號(hào)培養(yǎng)皿加入綠色熒光蛋白基因重組腺病毒。 二、MRI成像 胰酶消化后獲取

7、細(xì)胞懸液(經(jīng)計(jì)數(shù)為106個(gè)細(xì)胞)，1200rpm離心5分鐘使之沉淀于EP管底，仔細(xì)吸除上清后將1～4號(hào)離心管平行放置，分別代表空白對(duì)照及MOI為50、150、300轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞團(tuán)。行T1WI(TR/TE500/15ms)、T2WI(TR/TE2600/100ms)、STIR(TR/TE432/60ms)序列檢查，掃描線(xiàn)圈采用C3線(xiàn)圈，內(nèi)徑11cm，矩陣400×432，F(xiàn)ov15cm×15cm，層厚1.5mm，層距—0.7mm。

8、 三、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的驗(yàn)證 結(jié)果： 1.MRI檢查結(jié)果 對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行T1WI、T2WI、STIR檢查，轉(zhuǎn)染細(xì)胞團(tuán)均出現(xiàn)高信號(hào)，空白對(duì)照細(xì)胞團(tuán)未見(jiàn)高信號(hào)或僅出現(xiàn)微弱高信號(hào)，并呈現(xiàn)一種趨勢(shì)，轉(zhuǎn)染病毒量越大，信號(hào)越高。至MOI150以后，其信號(hào)增高不再明顯。 2.黑色素染色 轉(zhuǎn)染細(xì)胞染色較深，呈深褐色，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量黑褐色顆粒。空白對(duì)照細(xì)胞內(nèi)缺乏上述深褐色染色。 3.Real—Time PCR

9、 1～4號(hào)樣品中酪氨酸酶基因(Tyr)的表達(dá)量差異倍數(shù)分別為1、62.55、617.34、612.25。實(shí)驗(yàn)組的酪氨酸酶基因(Tyr)的表達(dá)量相對(duì)空白對(duì)照組顯著提高。 4.綠色熒光成像在熒光顯微鏡檢測(cè)中，絕大部分經(jīng)綠色熒光蛋白基因腺病毒重組體轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞內(nèi)都可見(jiàn)綠色熒光。 結(jié)論： 1、腺病毒作為運(yùn)送載體可以高效地運(yùn)送酪氨酸酶基因進(jìn)入HepG2細(xì)胞并成功表達(dá)。 2、酪氨酸酶基因作為報(bào)告基因，利用