腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾抑制VEGF及Ang-2基因表達(dá)治療肺腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測(cè)肺腺癌組織及癌旁正常組織中的VEGF及Ang-2的mRNA、蛋白表達(dá),構(gòu)建和鑒定VEGF及Ang-2靶向RNA干擾重組腺病毒,研究RNA干擾抑制VEGF及Ang-2基因表達(dá)對(duì)肺腺癌生物學(xué)特性的影響。 方法：①采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot法,檢測(cè)8例肺腺癌組織及癌旁正常組織中的VEGF及Ang-2 mRNA、蛋白表達(dá)。②利用基因重組技術(shù)構(gòu)建H1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)針對(duì)VEGF及Ang-2

2、siRNA的重組腺病毒Ad.H1-VEGFsbRNA及Ad.H1-Ang-2sbRNA。③體外轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞,應(yīng)用Westen-blot、ELISA檢測(cè)VEGF及Ang-2蛋白表達(dá)變化。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,MTT比色法及流式細(xì)胞分析測(cè)定A549細(xì)胞增殖的變化。④制備裸鼠A549細(xì)胞移植瘤模型,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。 結(jié)果：①肺腺癌組織中VEGF及Ang-2 mPdqA及蛋白表達(dá)量均比癌旁組織明顯增高。②成功構(gòu)建了VEGF及An

3、g-2靶向RNA干擾重組腺病毒。③體外轉(zhuǎn)染Ak549細(xì)胞后各RNA干擾組明顯抑制其增殖活性,細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染Ad-Null組均有顯著差異(P<0.01);且Ad.H1-VEGFsbRNA及Ad.H1-Ang-2sbRNA聯(lián)合干擾組分別與Ad.H1-VEGFsbRNA組、Ad.H1-Ang-2sbRNA組比較有顯著差異(P<0.05);Ad.H1-VEGFsbRNA組與Ad.H1-Ang-2sbRNA組比較

4、無顯著差異(P>0.05)。④重組腺病毒接種裸鼠30d后,各RNA干擾組與對(duì)照組比較,腫瘤體積及重量均明顯減小,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),并且Ad.H1-VFGFshRNA及Ad.H1-Ang-2shRNA聯(lián)合干擾組與單因子干擾組比較能夠更有效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.05);而Ad.H1-VEGFsbRNA組與Ad.H1-Ang-2sbRNA組比較無顯著差異(P>0.05)。⑤各RNA干擾組腫瘤HE染色可見出現(xiàn)多處出血

5、和片狀壞死,免疫組化染色顯示:RNA干擾組微血管密度明顯少于對(duì)照組,VEGF、Ang-2表達(dá)明顯少于對(duì)照組,細(xì)胞凋亡增加,PCNA標(biāo)記指數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.01.)。并且.Ad.H1-VEGFsbRNA及Ad.H1-Ang-2sbRNA聯(lián)合干擾組與單因子干擾比較能夠更有效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.05)。 結(jié)論：肺腺癌組織中蛋白水平及mRNA水平VEGF及Ang-2均呈高表達(dá),VEGF及Ang-2基因靶向RNA干擾體外