酪氨酸酶siRNA有效抑制小鼠酪氨酸酶基因表達(dá)的初步研究.pdf

1、目的： 通過RNAi技術(shù)，體外篩選出針對小鼠酪氨酸酶的有效siRNA，并利用篩選出的優(yōu)勢片段進(jìn)行C57BL/6小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，檢測體內(nèi)片段的干擾效率，以此探討針對小鼠酪氨酸酶的siRNA在體內(nèi)發(fā)揮RNAi作用的可行性，并進(jìn)一步為酪氨酸酶異常等人類疾病的動物模型制作及該類疾病的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.利用針對小鼠酪氨酸酶mRNA的不同干擾片段分別轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞系，同時(shí)采用陰性干擾片段轉(zhuǎn)染作為陰

2、性對照，單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作為空白對照。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酪氨酸酶活性測定和黑色素含量測定三種方法分三個時(shí)間點(diǎn)于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)對不同組的細(xì)胞干擾結(jié)果進(jìn)行檢測。 2.使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測該優(yōu)勢片段體內(nèi)干擾作用的可行性。利用體外篩選出的優(yōu)勢片段siNM_011661_001片段進(jìn)行C57BL/6小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用不同濃度的針對C57BL/6小鼠酪氨酸酶的優(yōu)勢片段siRNA進(jìn)行RNAi的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，該

3、實(shí)驗(yàn)采用玻璃體腔注射的方法進(jìn)行。24小時(shí)后于基因水平檢測該片段對小鼠視網(wǎng)膜酪氨酸酶的干擾效率。 結(jié)果： 1.siNM_011661_001、siNM_011661_002、siNM_011661_003三個干擾片段均能在轉(zhuǎn)染后發(fā)揮一定的干擾作用，其中siNM_011661_001在轉(zhuǎn)染后發(fā)揮的干擾效果最強(qiáng)，在降低酪氨酸酶基因mRNA表達(dá)、酶活性、以及黑素含量三方面分別能起到82.81％、64.73％、52.53％的抑制作

4、用。 2.玻璃體腔注射后siNM_011661_001片段后24小時(shí)，提取的視網(wǎng)膜mRNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示0.65nmol siNM_011661_001處理組與1.3nmolsiNM_011661_001處理組小鼠視網(wǎng)膜酪氨酸酶mRNA較僅用PBS處理過的小鼠的視網(wǎng)膜分別降低25.18％，60.80％。 結(jié)論： 針對小鼠酪氨酸酶的siNM_011661_001序列能在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮高效、穩(wěn)定的基因沉默作用，是