添加中藥的靈芝發(fā)酵及其酪氨酸酶抑制活性的研究.pdf

1、酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是哺乳動物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶。篩選天然來源的酪氨酸酶抑制劑，為美白化妝品或以酪氨酸酶為作用靶點藥物的開發(fā)提供依據(jù)。本研究從27種中藥中篩選出了適宜靈芝發(fā)酵的黃芩，優(yōu)化了添加黃芩的靈芝培養(yǎng)條件，并初步研究了靈芝發(fā)酵代謝產(chǎn)物的酪氨酸酶抑制活性。主要研究結(jié)果如下： 1.以兒茶酚為底物，420nm下鄰苯二醌的生成與反應(yīng)時間成正比，建立了體外分光光度法篩選酪氨酸酶抑制劑的測定體系，馬鈴薯酪氨酸酶的最適

2、反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為30℃和6.5。依據(jù)建立的酪氨酸酶測定體系，研究了27味中藥水提物、以及27味中藥經(jīng)靈芝發(fā)酵后的酪氨酸酶抑制活性。6g/L的中藥經(jīng)靈芝發(fā)酵后，黃芩、楊梅葉、綠茶、蘆薈、桑葉和銀杏葉較相同劑量的中藥水提液的酪氨酸酶抑制率分別提高31.80％、21.2％、17.94％、17.57％、25.83％和14.29％，以黃芩的增幅最高；其中未添加中藥的靈芝發(fā)酵液的酪氨酸酶抑制率為27.07％. 2.利用正交試驗L

3、16(45)和響應(yīng)面法優(yōu)化了靈芝深層發(fā)酵產(chǎn)生酪氨酸酶抑制劑的培養(yǎng)基組成。確定的最佳培養(yǎng)基組成為：黃芩，6.3g/L；麩皮，12.0g/L；蛋白胨，6.0g/L；玉米粉，15.6g/L；葡萄糖，6.8g/L；豆餅粉，11.3g/L；磷酸二氫鉀，1.5g/L。研究了培養(yǎng)條件對靈芝發(fā)酵產(chǎn)生酪氨酸酶抑制劑的影響，確定的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度，30℃；裝液量：150mL/500mL三角瓶；搖床轉(zhuǎn)速，125rpm.優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液凍干粉濃

4、度達到3.9mg/mL時，最大酪氨酸酶抑制率為53.47％，與模型預(yù)測的酪氨酸酶抑制率52.87％相符。25.0L反應(yīng)器中的驗證實驗表明發(fā)酵時間120h，最大酪氨酸酶抑制率為59.47％. 3.研究了優(yōu)化培養(yǎng)條件下，黃芩對靈芝發(fā)酵過程的影響。添加黃芩時，靈芝發(fā)酵過程的pH變化較未添加黃芩時緩和；靈芝發(fā)酵液的酪氨酸酶抑制活性顯著提高。以蘆丁為底物對靈芝轉(zhuǎn)化黃芩的機理進行了探討，研究中發(fā)現(xiàn)靈芝中的β-糖苷酶可能對蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素-3

5、-O-β-D-葡萄糖苷的過程起關(guān)鍵作用，由于糖基的去除，減少了黃酮與酪氨酸酶作用的空間位阻，增加了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的酪氨酸酶抑制活性。 4.對靈芝醇溶中性組分進行了GC-MS分析，檢測到了匹配度為100％的靈芝甾醇，質(zhì)譜中的主要離子碎片與化合物結(jié)構(gòu)非常吻合。靈芝醇溶中性組分對酪氨酸酶的半數(shù)抑制濃度IC50約為1.10mg/mL. 5.測定了靈芝酸的酪氨酸酶抑制活性，初步推斷靈芝酸對酪氨酸酶的抑制為反競爭性抑制。酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)