色象中藥調(diào)節(jié)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 色素代謝障礙性疾病(如白癜風(fēng)、黃褐斑等),發(fā)病率高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著生活水平的提高,人們更加重視這類疾病的防治。近年來,國內(nèi)開展中醫(yī)藥與色素代謝關(guān)系的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn),許多中藥對(duì)酪氨酸酶活性、黑素細(xì)胞代謝的影響已經(jīng)有了初步的揭示,研究的方法技術(shù)亦日益成熟。但是,目前大多數(shù)研究都局限于觀察單味中藥或復(fù)方中藥的研究上,鮮有從中藥色象理論的角度設(shè)計(jì)較為系統(tǒng)的多層次的研究,有關(guān)色象中藥對(duì)黑素代謝影響與

2、干預(yù)機(jī)理的研究尚為缺乏。中醫(yī)在長期醫(yī)療實(shí)踐中積累了“以白治黑,以黑治白”的臨床經(jīng)驗(yàn),導(dǎo)師楊柳教授通過長期的臨床探索與理論研究,在取象比類思維啟示下創(chuàng)立了治療色素性皮膚病的中藥色象理論,形成了具有鮮明特色的理論和治療方法。認(rèn)為中藥顏色與色素性皮膚病的療效有一定的相關(guān)性,并首次將這種表明藥材顏色與療效相關(guān)的現(xiàn)象稱之為“中藥色象”,將這種治療色素病色效相關(guān)的中藥,稱之為“色象中藥”。初步研究中藥藥材顏色與色素性皮膚病的療效之間的關(guān)系,并取得了

3、一定的成果。
　　 另外,白蒺藜作為臨床上治療色素代謝障礙性疾病常用藥物,既治療色素增加病,又治療色素減退病。近年來有關(guān)白蒺藜對(duì)酪氨酸酶活性的實(shí)驗(yàn)研究有不少報(bào)道,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道差異較大,甚至相反。我們以往的初步研究結(jié)果表明白蒺藜具有雙向調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞增殖和酪氨酸酶活性的作用,但其雙向調(diào)節(jié)的內(nèi)在機(jī)制尚未十分清楚。因此,對(duì)色象中藥調(diào)節(jié)黑素瘤細(xì)胞代謝及白蒺藜雙向調(diào)節(jié)黑素代謝這兩方面的研究,是非常有必要的,這對(duì)于中醫(yī)藥理論發(fā)展、中藥開發(fā)研

4、究、色素病理論的創(chuàng)新以及臨床實(shí)踐的指導(dǎo)都具有較好的應(yīng)用前景與實(shí)際意義。
　　 基于此,本研究通過查閱大量的文獻(xiàn)資料及臨床資料,并結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),篩選出中醫(yī)傳統(tǒng)治驗(yàn)及現(xiàn)代研究表明治療色素病有效的使用頻率高的黑白兩類中藥各10種,以目前研究技術(shù)較為成熟的酪氨酸酶、細(xì)胞增殖及黑素合成作為觀察指標(biāo),研究色象中藥對(duì)體外培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶活性的影響,以及采用中藥血清學(xué)的方法研究白蒺藜雙向調(diào)節(jié)色素代謝的作用機(jī)制,探討色象中藥與色素代

5、謝的相關(guān)性,為色象理論及臨床辨證用藥提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)為中醫(yī)藥治療色素病的研究提供新的思路,并對(duì)中醫(yī)藥治療色素病的理論進(jìn)行新的梳理,進(jìn)而能夠有效地指導(dǎo)臨床。
　　 方法與內(nèi)容：
　　 1、通過查閱大量的文獻(xiàn)資料及臨床資料,并結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),篩選出中醫(yī)傳統(tǒng)治驗(yàn)及現(xiàn)代研究表明治療色素病有效的使用頻率高的中藥,依據(jù)飲片的外在顏色分為黑(深色)、白(淺色)兩組,每組各選10味藥作為代表藥,制備各單味中藥水提液,并用不含胎牛血清

6、的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,使藥物終質(zhì)量濃度為20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml。
　　 2、參照醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)及中藥血清學(xué)的方法,制備不同給藥劑量白蒺藜含藥血清,并用不含胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,使三種給藥劑量含藥血清藥物終質(zhì)量濃度均為20μg/ml,并以此濃度進(jìn)行研究。
　　 3、應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)技術(shù),將黑素瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用多巴速率氧化法測定黑白兩組不同濃度中藥水提取液、不同給藥劑量白蒺藜含藥血清對(duì)細(xì)胞中酪氨

7、酸酶活性的影響；采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定不同給藥劑量白蒺藜含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響；采用NaOH裂解法測定不同給藥劑量白蒺藜含藥血清對(duì)細(xì)胞中黑素合成含量的影響。每種藥物每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次,并設(shè)對(duì)照組。
　　 3、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,每一實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,采用單因素方差分析的Dunnett檢驗(yàn)比較黑白兩組中藥不同濃度實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組之間的差異性；動(dòng)物血清實(shí)驗(yàn)采用LSD—t檢驗(yàn)進(jìn)

8、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P<0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、中藥調(diào)節(jié)酪氨酸酶活性測定結(jié)果:與空白對(duì)照組相比較,黑色組藥物中,雞血藤、丹參、菟絲子、補(bǔ)骨脂在低、中、高濃度(5、10、20μg/ml)、制首烏、紅花、女貞子在中、高濃度(10、20μg/ml)、熟地、益母草在高濃度(20μg/ml)、墨旱蓮在低濃度(5μg/ml)對(duì)酪氨酸酶活性有明顯促進(jìn)作用(f<0.05或P<0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)

9、。白色組中,白芨、山藥在高濃度(20μg/ml)、茯苓、白芍在中、高濃度(10、20μg/ml)、白蒺藜、白芷、當(dāng)歸在低、中濃度(5、10μg/ml)對(duì)酪氨酸酶活性有明顯抑制作用(P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。而白芷、白蒺藜、當(dāng)歸在高濃度(20μg/ml)、桃仁在中、高濃度(10、20μg/ml)、白茯苓、自芍在低濃度(5μg/ml)對(duì)酪氨酸酶活性則有促進(jìn)作用。白術(shù)、薏苡仁與空白對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

10、>　　 2、白蒺藜含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響結(jié)果:低劑量組與空白組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),有明顯抑制細(xì)胞增殖作用；高劑量組、陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),有明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖作用(P<0.01或P<0.05)；中劑量組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低劑量組與陽性對(duì)照組相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),具有明顯抑制細(xì)胞增殖的作用；高劑量組、中劑量組與陽性對(duì)照組比

11、較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3、白蒺藜含藥血清對(duì)黑素合成的影響結(jié)果:低劑量組與空白對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),有明顯抑制細(xì)胞增殖作用；高劑量組、陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),有明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖作用；中劑量組與空白對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低劑量組與陽性對(duì)照組相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),具有明顯抑制細(xì)胞增殖作用；

12、高劑量組、中劑量組與陽性對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 全文結(jié)論：
　　 1、黑(深)色組10味中藥對(duì)細(xì)胞中酪氨酸酶活性均有促進(jìn)作用,并呈現(xiàn)隨濃度的增高而增強(qiáng)的趨勢；白(淺)色組10味中藥中有7種中藥對(duì)細(xì)胞中酪氨酸酶活性具有抑制作用,呈現(xiàn)隨濃度的增高而增強(qiáng)的趨勢。說明黑(深)色組中藥對(duì)酪氨酸酶活性的促進(jìn)作用更明顯,而白(淺)色組中藥對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用更明顯。
　　 2、白蒺藜、白芷、白

13、茯苓、白芍、熟地黃五味中藥對(duì)細(xì)胞中酪氨酸酶活性具有雙向調(diào)節(jié)作用。如白蒺藜、白芷呈現(xiàn)為低濃度抑制高濃度促進(jìn)；白茯苓、白芍、熟地黃則呈現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制。
　　 3、桃仁雖為白色但對(duì)細(xì)胞中酪氨酸酶活性起到促進(jìn)作用。
　　 4、白色組中藥中,白術(shù)、薏苡仁對(duì)細(xì)胞中酪氨酸酶活性不具有促進(jìn)或抑制作用。
　　 5、白蒺藜含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖、黑素合成含量的影響與大鼠給藥劑量有關(guān),并呈現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用,即低、中劑量含藥血清(