馬拉色菌對培養(yǎng)人黑素細胞代謝及酪氨酸酶基因表達的影響.pdf

1、[目的]：馬拉色菌感染所致花斑癬的基本皮膚損害包括色素減退和/或色素沉著，皮膚色素改變除考慮個體差異性外，是否與不同菌種或菌株的生物學特性差異有關?本課題將①馬拉色菌與角質形成細胞共同培養(yǎng)后的上清和②馬拉色菌分別加入黑素細胞培養(yǎng)體系中，探討馬拉色菌對培養(yǎng)人黑素細胞酪氨酸酶活性、黑素含量及酪氨酸酶mRNA表達的影響。 [方法]：將人包皮表皮細胞懸液用MCDB153培養(yǎng)基添加佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol

2、-14-acetate，TPA)、霍亂毒素(Choleratoxin，CT)、重組人表皮細胞生長因子(recombinanhumanepidermalgrowthfactor，rhEGF)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Isobutylmethylxanthine，IBMX)等進行黑素細胞純化培養(yǎng)。用多巴染色、Fontana銀染和S-100蛋白免疫組化染色法鑒定培養(yǎng)的黑素細胞。利用氧化反應原理建立酪氨酸酶活性檢測體系。將7種馬拉色菌分別與

3、角質形成細胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時后，獲得共同培養(yǎng)上清液，按1：1，1：3，1：7(上清體積：黑素細胞培養(yǎng)液體積)加入黑素細胞培養(yǎng)體系中，24小時后觀察黑素細胞增殖情況(MTT法)、測定酪氨酸酶活性(氧化多巴反應)、黑素含量(NaOH溶解法)、酪氨酸酶mRNA的表達(實時熒光定量PCR法)以及超微結構的變化。 [結果]：1.建立了黑素細胞純化培養(yǎng)體系，能在體外培養(yǎng)及傳代5次。多巴染色、Fontana銀染和S-100蛋白

4、免疫組化染色均證實為黑素細胞。2.酪氨酸酶活性檢測體系穩(wěn)定可靠。最適反應緩沖液為pH9.0、0.25mol/LTris-HCl；底物左旋多巴最大溶解度為0.15％，使用pH8.0、0.01mol/LTris-HCl溶解；在配制反應底物左旋多巴時加入0.03％H2O2可提高反應的敏感性：酪氨酸酶活性檢出的最適細胞數為≥2.5×104個，反應高峰出現在20分鐘之內，且與黑素細胞數有關，細胞數越多，反應高峰出現的時間越早。3.黑素細胞經球形馬

5、拉色菌與角質形成細胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時的上清處理24小時后，酪氨酸酶活性較對照組增加，每分鐘內酶變化A450值從1.298±0.046增至1.559±0.059；黑素含量亦較對照組增加，從6.593±0.852mg/L增至13.715±0.811mg/L；酪氨酸酶mRNA的表達亦較對照組增強，熒光定量PCR結果用酪氨酸酶(TYR)基因擴增熒光強度與內參照三磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)基因擴增熒光強度之比表示，其值從0.91

6、1±0.562增至35.445±26.297；超微結構顯示，黑素細胞胞漿內可見豐富的線粒體、內質網、核糖體及大量的黑素顆粒。4.黑素細胞經除球形馬拉色菌外的其他6種馬拉色菌與角質形成細胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時的上清處理24小時后，酪氨酸酶活性、黑素含量、酪氨酸酶mRNA的表達與對照組相比無統(tǒng)計學差異。5.黑素細胞經7種馬拉色菌直接刺激24小時后，酪氨酸酶活性較對照組無統(tǒng)計學差異。 [結論]：1.球形馬拉色菌與角質形成細

7、胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時的上清刺激黑素細胞24小時后在蛋白質水平能提高酪氨酸酶活性和黑素含量，在基因水平能提高酪氨酸酶mRNA的表達，超微結構顯示，胞漿內有豐富的線粒體、內質網、核糖體及大量的黑素顆粒，表明其黑素代謝增加。2.除球形馬拉色菌外的其他6種馬拉色菌與角質形成細胞株(HaCat)共同培養(yǎng)24小時的上清處理黑素細胞24小時后，其酪氨酸酶活性、黑素含量、酪氨酸酶mRNA的表達與對照組相比無改變。3.馬拉色菌直接刺激黑素細