桑色素對酪氨酸酶、黃嘌呤氧化酶抑制機理的探討.pdf

1、一直以來，人體皮膚病如黃褐斑、老年斑、妊娠斑等都是十分困擾人們的常見疾病，所以，美白祛斑化妝品和美白食品的研究受到廣泛關(guān)注和發(fā)展。痛風(fēng)(一種由過高的尿酸引起的疾病)已被聯(lián)合國列為21世紀(jì)20大頑癥之一，而且隨著生活水平的提高、生活節(jié)奏的加快和人們的飲食結(jié)構(gòu)的不合理，我國痛風(fēng)的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已高于世界平均水平。據(jù)報道，在人體中，酪氨酸酶主要是催化機體生成黑色素，其過量表達(dá)會使黑色素聚集，從而導(dǎo)致皮膚病的產(chǎn)生，所以，抑制酪氨酸酶的活性是

2、祛斑美白的重要手段；黃嘌呤氧化酶是人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸過程中的一個關(guān)鍵性酶，是產(chǎn)生痛風(fēng)的重要因素，因此，將黃嘌呤氧化酶作為藥物的作用靶點，抑制其活性也是臨床治療痛風(fēng)的主要途徑。
　　近年來，科學(xué)工作者在祛斑和抗痛風(fēng)藥物合成、研發(fā)方面取得了一定的成果，然而，這些合成藥物大部分具有一定的副作用，這在一定程度上限制了它們的應(yīng)用。黃酮類化合物以其廣泛的生物活性受到了人們的青睞，從植物黃酮類化合物中尋找和篩選有效的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制劑，進(jìn)

3、而為祛斑和痛風(fēng)病治療提供新的藥物選擇已受到科技工作者的普遍關(guān)注。本文分別以酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶作為靶點，運用多種現(xiàn)代分析技術(shù)如抑制動力學(xué)技術(shù)、熒光光譜技術(shù)、圓二色譜技術(shù)等，并結(jié)合分子模擬手段研究了常見黃酮類化合物桑色素對上述兩種酶的抑制動力學(xué)和抑制機理，以期為桑色素在化妝品和抗痛風(fēng)藥物方面的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為研究其它活性組分對酶的抑制作用提供方法借鑒和技術(shù)支持。
　　本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.簡要介紹

4、了酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶的結(jié)構(gòu)、催化功能和生理特性；概述酪氨酸酶抑制劑和黃嘌呤氧化酶抑制劑的研究進(jìn)展。
　　2.以酪氨酸酶為靶點，采用抑制動力學(xué)方法、熒光光譜法和圓二色譜法，在pH6.8的磷酸鹽緩沖體系中，研究了室溫條件下桑色素對酪氨酸酶的抑制機制。抑制動力學(xué)研究結(jié)果表明，桑色素通過多相動力學(xué)過程可逆地與酶催化底物左旋多巴(L-DOPA)競爭性地結(jié)合到酪氨酸酶的活性中心，其半數(shù)抑制濃度IC50和抑制常數(shù)Ki分別為(8.13±1.2

5、1)×10-5L/mol、(7.32±0.36)×10-5L/mol，桑色素顯示較強的酪氨酸酶抑制活性。熒光光譜法研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑色素主要通過氫鍵和范德華力結(jié)合到酪氨酸酶上的一個特定位置，形成基態(tài)復(fù)合物，從而靜態(tài)地猝滅酪氨酸酶的內(nèi)源熒光，在298K溫度下的結(jié)合常數(shù)為8.10×104L/mol。兩者之間可能發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，結(jié)合距離為5.12nm。圓二色譜分析顯示，桑色素的存在誘導(dǎo)了酪氨酸酶的β-折疊含量增加，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)

6、則轉(zhuǎn)曲的含量降低。分子模擬結(jié)果直觀地展現(xiàn)出桑色素與酪氨酸酶的結(jié)合區(qū)域與結(jié)合模式，桑色素插入到酪氨酸酶的活性中心，與其周圍的一些氨基酸殘基His85、His94、His244、His259、Asn260、His263、Phe264、Met280、Gly281、Val283和His296等發(fā)生相互作用，并且形成了兩個氫鍵。推測桑色素對酪氨酸酶的抑制機理可能是桑色素插入到酪氨酸酶的活性位點，不但占據(jù)了酪氨酸酶對底物L(fēng)-DOPA的催化中心，阻礙

7、了底物的進(jìn)入，而且還誘導(dǎo)了酪氨酸酶構(gòu)象的變化，直接導(dǎo)致酪氨酸酶的活性降低。
　　3.在pH7.5的磷酸鹽緩沖液體系中，測定了桑色素對黃嘌呤氧化酶的抑制率和抑制類型，研究了桑色素與黃嘌呤氧化酶的結(jié)合特性，桑色素對黃嘌呤氧化酶構(gòu)象的影響以及山奈酚對桑色素抑制黃嘌呤氧化酶活性的影響。實驗結(jié)果表明，桑色素是一種較強的、可逆的混合型黃嘌呤氧化酶抑制劑，其IC50為1.35×10–5mol/L，抑制常數(shù)Ki和抑制系數(shù)α分別為1.21×10-5

8、mol/L和1.94；桑色素在黃嘌呤氧化酶有一個結(jié)合位點，在298K時的結(jié)合常數(shù)Ka為3.22×104L/mol，該結(jié)合過程是一個吸熱和熵驅(qū)動過程，疏水作用力是其作用的主要驅(qū)動力。分子對接發(fā)現(xiàn)，桑色素分子進(jìn)入黃嘌呤氧化酶的疏水空腔，與活性中心(含Mo區(qū)域)周圍的一些主要氨基酸殘基Ser1075、Pro076、Asn768、Lys771、Leu648和Leu1014等發(fā)生作用。圓二色譜分析表明，桑色素與黃嘌呤氧化酶作用誘導(dǎo)了酶二級結(jié)構(gòu)發(fā)生

9、改變。桑色素抑制黃嘌呤氧化酶的活性可能一方面是由于桑色素結(jié)合到酶的疏水空腔中，占據(jù)了底物進(jìn)入活性中心的通道，從而降低了黃嘌呤氧化酶對底物的催化速率；另一方面是由于桑色素結(jié)合到XO上，誘導(dǎo)XO的結(jié)構(gòu)更加緊湊而不利于其活性中心暴露于反應(yīng)環(huán)境中，從而降低了XO與底物的接觸。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在桑色素濃度為2.0×10-6mol/L、山奈酚濃度為2.0×10-6或8.0×10-6mol/L，和桑色素濃度為1.4×10-5mol/L、山奈酚濃度為8

10、.0×10-6mol/L時，它們對黃嘌呤氧化酶具有良好的協(xié)同抑制效應(yīng)，這可能是因為它們不僅占據(jù)了XO的活性中心，還占據(jù)了底物進(jìn)入XO活性中心的通道，并且同時對XO的構(gòu)象產(chǎn)生影響。
　　4.采用多種光譜方法結(jié)合分子模擬技術(shù)，研究了山奈酚對黃嘌呤氧化酶的抑制機理和木犀草素對山奈酚抑制黃嘌呤氧化酶活性的影響。實驗結(jié)果表明，山奈酚是一種有效的可逆性黃嘌呤氧化酶抑制劑，能夠與底物黃嘌呤競爭性的結(jié)合到黃嘌呤氧化酶的活性位點，其IC50和Ki分

11、別為(2.18±0.02)×10-6mol/L和(6.77±1.02)×10-6mol/L。山奈酚通過靜態(tài)猝滅過程與黃嘌呤氧化酶形成基態(tài)復(fù)合物，疏水作用是主要驅(qū)動力。山奈酚引起黃嘌呤氧化酶中酪氨酸和色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性增強，疏水性降低，α-螺旋和無規(guī)則卷曲的含量降低，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量升高。分子模擬結(jié)果顯示，山奈酚插入到黃嘌呤氧化酶的疏水空腔，與周圍的一些主要氨基酸殘基如Glu802、Leu873、Phe914、Arg880、

12、Phe1009、Thr1010、Val1011、Leu1014和Pro1076等發(fā)生作用，并與Asn768和Luz1(與Mo原子相連的輔酶因子)形成了兩個氫鍵。山奈酚對黃嘌呤氧化酶的抑制作用機制很可能是因為山奈酚插入到黃嘌呤氧化酶的活性位點，不但占據(jù)了黃嘌呤氧化酶的催化中心，阻礙了底物黃嘌呤的進(jìn)入，還誘導(dǎo)黃嘌呤氧化酶的構(gòu)象發(fā)生變化，直接導(dǎo)致黃嘌呤氧化酶的催化活性的降低。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在山奈酚濃度為0.5×10-6mol/L，山奈酚濃