抗氧化劑原花色素對蘑菇酪氨酸酶活性的影響及機(jī)理研究.pdf

1、原花色素是一類具有生理生化活性且廣泛存在于植物樹干、葉子和果實(shí)中的多酚物質(zhì)。因此，原花色素是藥品開發(fā)的良好來源。酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是一種廣泛分布于自然界的含銅離子的氧化還原酶。在人體中酪氨酸酶的異常表達(dá)能引起雀斑和黑色素沉積等皮膚病。最近有研究表明酪氨酸酶與帕金森綜合癥及其他神經(jīng)衰弱疾病相關(guān)。此外，酪氨酸酶在昆蟲的蛻皮及果蔬褐變中也起了關(guān)鍵的作用。因此，酪氨酸酶抑制劑在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、制藥業(yè)尤其是在化妝品行業(yè)中有重要開發(fā)價(jià)值

2、。
　　本課題首先運(yùn)用響應(yīng)曲面法對黃葛樹樹葉多酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，采用總酚提取率(EAP)、總黃酮提取率(EAF)、DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力(FRAP)為優(yōu)化指標(biāo)。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取次數(shù)是多酚提取的主要影響因素，且這些信息被用于后續(xù)的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中。響應(yīng)曲面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能很好的被二元方程擬合，擬合度高達(dá)98％。通過擬合得到的總酚提取率、總黃酮提取率、DPPH自由基清除能力和FRAP

3、的最佳提取條件。在綜合考慮這四個(gè)指標(biāo)后得出的最優(yōu)提取條件為:乙醇濃度58％、溫度57℃、時(shí)間37min和重復(fù)提取3次。此外，我們還發(fā)現(xiàn)EAP、EAF與抗氧化能力有很強(qiáng)的線性相關(guān)。
　　我們進(jìn)一步采用13C核磁共振、反相高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用和基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)研究了黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮，魚尾葵果皮和果肉以及印度塔樹樹葉原花色素的結(jié)構(gòu)組成。除印度塔樹樹葉原花色素只包含原花青定外，其它種類的

4、原花色素都同時(shí)含有原翠雀定和原花青定且以B型連接相連。質(zhì)譜最高峰之間相距質(zhì)量分?jǐn)?shù)為288Da，這對應(yīng)一個(gè)兒茶素/表兒茶素單元。MALDI-TOF-MS檢測到黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮原花色素的聚合度分布分別為三到六聚體、三到十二聚體和三到十五聚體，印度塔樹樹葉原花色素的聚合度由三到十四聚體。此外，除了印度塔樹樹葉原花色素外其他原花色素結(jié)構(gòu)在每個(gè)最高峰旁邊還出現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差16Da的小峰，這種峰的出現(xiàn)表明組成這些多聚體的單體的B環(huán)結(jié)構(gòu)上僅存在

5、一個(gè)羥基。同時(shí)，在魚尾葵果肉原花色素的質(zhì)譜峰中還出現(xiàn)一系列相差272Da的峰，這表明魚尾葵果肉原花色素存在只由阿福豆素/表阿福豆素相連形成的均聚體。
　　我們通過DPPH、ABTS自由基清除能力以及FRAP法進(jìn)一步探討黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮，魚尾葵果皮和果肉以及印度塔樹樹葉原花色素的抗氧化能力。黃葛樹中黃葛樹樹皮原花色素具有抗氧化能力最強(qiáng)，其DPPH和ABTS自由基清除能力的IC50分別為109.20±0.99和80.82±3.3

6、1μg/mL，其FRAP值為688.34±24.14毫克維C當(dāng)量每克干重(mgAAE/gd.w.)。魚尾葵果皮原花色素比魚尾葵果肉原花色素抗氧化活性更強(qiáng)，他們的DPPH和ABTS自由基清除能力分別為142.86±1.53和80.51±0.4μg/mL以及157.42±1.87和83.18±1.22μg/mL，其FRAP值分別為373.09±5.02和317.91±13.06mgAAE/gd.w.。印度塔樹樹葉原花色素的DPPH和ABTS

7、自由基清除能力的IC50分別為89.32±12.07和76.79±5.88μg/mL，F(xiàn)RAP值為710.54±142.82mgAAE/gd.w.。對原花色素的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性關(guān)系的分析表明原花色素B環(huán)的3'羥基對抗氧化力起增強(qiáng)作用。
　　我們進(jìn)一步對黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮，魚尾葵果皮和果肉以及印度塔樹樹葉原花色素對蘑菇酪氨酸酶活性的影響進(jìn)行研究。而且對黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮原花色素對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制機(jī)理和動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析。同

8、時(shí)，我們采用熒光猝滅、銅離子相互作用和分子對接技術(shù)探討黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮原花色素對酪氨酸酶的抑制機(jī)理。黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮原花色素對酪氨酸酶都有很強(qiáng)的抑制作用（特別是果實(shí)原花色素）且屬于混合型抑制劑。黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮原花色素對蘑菇酪氨酸酶單酚酶的IC50值分別為131.67、99.89和106.22μg/mL;對雙酚酶的IC50值分別為128.42±0.45、43.07±0.62和74.27±0.68μg/mL。抑制機(jī)理研究

9、表明黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮原花色素可能通過與酪氨酸酶活性中心的銅離子螯合而抑制酶活。此外，黃葛樹樹葉、果實(shí)和樹皮原花色素還能還原酪氨酸酶的氧化產(chǎn)物多巴醌。魚尾葵果皮原花色素具有抑制酪氨酸酶的作用，而魚尾葵果肉原花色素則含有大量表兒茶素（酪氨酸酶的二酚酶底物）。印度塔樹樹葉原花色素對雙酚酶的IC50值為773.09±1.47μg/mL。
　　總之，通過本課題的研究，分離純化得到高效酪氨酸酶抑制劑原花色素，并對原花色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、抗氧