酪氨酸酶-黑色素報告基因系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞表達(dá)的MRI實(shí)驗研究.pdf

1、研究背景：分子影像學(xué)作為一門新興的交叉學(xué)科，近十年來在世界范圍內(nèi)得到了迅猛的發(fā)展。MRI由于具有空間、時間分辨率高，無電離輻射，能同時獲得解剖及生理信息等優(yōu)點(diǎn)，近年來成為分子影像學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，已經(jīng)開發(fā)的MR分子影像對比劑主要分為兩大類：磁性對比劑和MR報告基因系統(tǒng)。酪氨酸酶-黑色素系統(tǒng)利用酪氨酸酶催化黑色素的合成，合成的黑色素與金屬離子高效螯合，從而縮短金屬離子的T1弛豫時間，造成MRI T1WI上呈特征性高信號。酪氨酸酶-黑色素

2、報告基因系統(tǒng)在MR顯像時無須特殊的標(biāo)記，相對其它報告基因系統(tǒng)簡單、易行。國內(nèi)外對酪氨酸酶-黑色素系統(tǒng)作為MR報告基因的可行性進(jìn)行了較多的研究，但是對于動態(tài)監(jiān)測酪氨酸酶基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況以及細(xì)胞內(nèi)黑色素含量與MR影像關(guān)系的研究國內(nèi)外文獻(xiàn)較少。
　　 研究目的:
　　 1、探討酪氨酸酶-黑色素系統(tǒng)作為MR報告基因的可行性。
　　 2、在體外細(xì)胞內(nèi)，初步探討MRI對轉(zhuǎn)染酪氨酸酶基因的HepG2細(xì)胞的動態(tài)監(jiān)測作用，最

3、佳顯像時間及顯像的持久性。
　　 3、探討轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)黑色素含量與MR影像的關(guān)系。
　　 材料和方法:
　　 1、酪氨酸酶基因重組質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取將pcDNA3.0-tyr重組質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增，采用QIAGENplasmid midi kit提取、純化重組質(zhì)粒。
　　 2、酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞每瓶細(xì)胞生長至106個時以PBS輕柔沖洗2次，再用10ml無血清高糖DMEM培養(yǎng)液換液。將3

4、0瓶細(xì)胞隨機(jī)分為6組，每組5瓶，采用陽離子脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染10μg空白質(zhì)粒、1μg、2μg、5μg、10μg、20μg重組質(zhì)粒。
　　 3、MRI檢查選取轉(zhuǎn)染后3天、7天、14天、28天、56天5個時間點(diǎn)，每組細(xì)胞各收集106個，行MRI T1WI掃描，分別測量各組細(xì)胞團(tuán)的信號強(qiáng)度，動態(tài)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的信號變化情況。
　　 4、轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測定與MR檢查時間對應(yīng)，分別取轉(zhuǎn)染后3天、7天、14天、28天、56天5

5、個時間點(diǎn)，采用分光光度法定量檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)黑色素含量，評價細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的變化情況。
　　 5、轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶基因表達(dá)和黑色素合成的驗證分別采用實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶(Tyr)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，Masson-Fontana浸銀法及電鏡檢查驗證轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成。
　　 6、統(tǒng)計學(xué)分析各時間點(diǎn)各組細(xì)胞信號強(qiáng)度的比較采用方差分析和LSD-t檢驗，細(xì)胞內(nèi)黑色素含量與T1WI信號強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)性分

6、析采用Pearson積矩相關(guān)分析。統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS16.0軟件包，p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的MRI動態(tài)監(jiān)測每個時間點(diǎn)6組細(xì)胞間比較：各時間點(diǎn)空白對照組細(xì)胞團(tuán)均呈低信號。第3、7天實(shí)驗組細(xì)胞團(tuán)隨轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒量的增多，T1WI信號強(qiáng)度逐漸增高(p＜0.05)；第14天2μg組與5μg組間T1WI信號強(qiáng)度差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.748)，其它每兩組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.

7、05)；第28天空白對照組與各實(shí)驗組間T1WI信號強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，而各實(shí)驗組間均無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)；第56天6組細(xì)胞間T1WI信號強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。每組細(xì)胞不同時間點(diǎn)變化趨勢：空白對照組T1WI信號強(qiáng)度變化趨勢基本呈一條水平線。1μg組、2μg組、5μg組、10μg組于第14天T1WI信號強(qiáng)度達(dá)最高，第56天達(dá)最低。20μg組于第7天T1WI信號強(qiáng)度達(dá)最高，第56天達(dá)最低。
　　

8、2、轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的定量檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞黑色素含量隨時間變化趨勢：基本與T1WI信號強(qiáng)度相對應(yīng)。空白對照組細(xì)胞黑色素含量隨時間變化趨勢基本呈一條水平線。1μg組、5μg組、20μg組于第7天黑色素含量最高；2μg組、10μg組于第14天黑色素含量最高；第56天各實(shí)驗組細(xì)胞黑色素含量最低，與空白對照組無明顯差異(p＞0.05)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)黑色素含量與T1WI信號強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.946(p＜0.05)

9、。
　　 3、酪氨酸酶基因表達(dá)和黑色素合成的驗證實(shí)時熒光定量RT-PCR：各實(shí)驗組細(xì)胞中酪氨酸酶(Tyr)mRNA表達(dá)量相對空白對照組顯著增高。Masson-Fontana浸銀法：實(shí)驗組細(xì)胞內(nèi)見大量金屬銀顆粒沉著，空白對照細(xì)胞缺乏上述黑褐色金屬銀顆粒的沉著。電鏡檢查：實(shí)驗組細(xì)胞胞漿中見到合成的黑色素小體。
　　 結(jié)論:
　　 1、酪氨酸酶-黑色素系統(tǒng)可以作為MR報告基因反映體外細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染情況。