黑色素濃集激素受體2（MCHR2）基因表達(dá)及其功能研究.pdf

1、肥胖癥是由于體脂過度堆積而產(chǎn)生的慢性疾病，是心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、高脂血癥以及癌癥等多種疾病的高危因素，現(xiàn)已成為全球性的健康問題。多年來研究發(fā)現(xiàn)肥胖的發(fā)生與下丘腦對攝食的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控密切相關(guān)，由下丘腦分泌的促食肽黑色素濃集激素(MCH)及其受體(MCHR1和MCHR2)的發(fā)現(xiàn)為肥胖發(fā)生機(jī)制及防治的研究提供了新的靶點(diǎn)。通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物模型已對MCH及MCHR1與肥胖及能量代謝的關(guān)系進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，但有關(guān)MCHR

2、2的功能及其與肥胖的關(guān)系至今仍不清楚。因此，本課題應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建人MCHR2真核表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，分析其表達(dá)、定位及生物學(xué)活性，進(jìn)而以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為研究對象，探討MCHR2是否具備調(diào)控能量平衡的生理功能，為深入研究MCHR2與肥胖的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容包括以下三個部分： 1．MCHR2真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定。 方法：以人胎腦cDNA文庫為模板PCR擴(kuò)增獲取MCHR2基因全長cDNA編

3、碼區(qū)序列，定向插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)抗生素平板篩選獲得陽性克隆，再分別進(jìn)行酶切、PCR及DNA測序鑒定。 結(jié)果：獲得了長為1023bp的人MCHR2 cDNA全長的目的片段，并插入到pcDNA3.1(+)載體的CMV啟動子下游構(gòu)建了表達(dá)MCHR2的重組質(zhì)粒，酶切和PCR鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒帶有目的基因片段，DNA測序確認(rèn)插入片段的序列準(zhǔn)確無誤。 結(jié)論：表達(dá)人MCHR2蛋白的真核表達(dá)載體

4、pcDNA3.1-MCHR2構(gòu)建成功。 2．MCHR2在CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)及其生物學(xué)活性的分析。 方法：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1-MCHR2真核表達(dá)載體導(dǎo)入CHO細(xì)胞，經(jīng)G418篩選抗性細(xì)胞克隆，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，RT-PCR、Westernblot檢測MCHR2轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)，免疫熒光檢測MCHR2在細(xì)胞中的定位，放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測受體的密度和親和力，通過測定細(xì)胞內(nèi)cAMP、Ca<'2+>濃度

5、的改變分析MCHR2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)果：經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418抗性篩選6～8周，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCHR2質(zhì)粒的CHO細(xì)胞系；在該細(xì)胞系中MCHR2基因能被有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，并準(zhǔn)確定位于細(xì)胞膜上，與<'125>I-MCH的結(jié)合具有特異、高親和及可飽和的配體-受體結(jié)合特性，其最大結(jié)合容量B<,max>值為309.97±1.14fmol/mg protein，平衡解離常數(shù)K<,d>值為0.170±0.0006nm

6、ol/L；MCH作用于MCHR2后不影響細(xì)胞內(nèi)cAMP生成，可促使細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放Ca<'2+>進(jìn)而使胞內(nèi)Ca<'2+>濃度出現(xiàn)明顯而短暫的升高，Ca<'2+>振蕩過程在MCH刺激后30～50s內(nèi)完成，其對Ca<'2+>釋放的作用呈劑量依賴關(guān)系，半數(shù)有效濃度EC<,50>為2.32±0.01nmol/L，提示MCHR2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是與G<,q>蛋白偶聯(lián)。 結(jié)論：建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCHR2的CHO細(xì)胞系，從MCHR2的表達(dá)、定位、受

7、體活性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面證實(shí)了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-MCHR2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后能有效表達(dá)具有生物學(xué)活性的MCHR2蛋白，為后續(xù)體外研究MCHR2基因的功能提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 3．MCHR2對脂肪細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 方法：通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCHR2質(zhì)粒的3T3-L1前脂肪細(xì)胞系，命名為3T3-L1-MCHR2細(xì)胞，作為對照的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞命名為3T3-

8、L1-mock細(xì)胞；RT-PCR、Western blot、免疫熒光檢測、放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>檢測鑒定MCHR2的表達(dá)及活性；MTT法檢測細(xì)胞增殖，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞周期分布；激素雞尾酒法(MIX+DEX+insulin)誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化，油紅O染色觀察脂肪細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)改變及量化分化程度，RT-PCR檢測脂肪細(xì)胞分化成熟的標(biāo)記基因；檢測成熟脂肪細(xì)胞中TG的生成、FFA及Leptin的分泌。 結(jié)果：建立了穩(wěn)定

9、轉(zhuǎn)染細(xì)胞系——3T3-L1-MCHR2，并通過了MCHR2表達(dá)和活性的鑒定；對前脂肪細(xì)胞增殖和分化特性作比較分析，可見MCH對3T3-L1-MCHR2和3T3-L1-mock細(xì)胞的增殖無影響，對兩株細(xì)胞的分化則有一定的促進(jìn)作用，兩者相比，3T3-L1-MCHR2細(xì)胞的分化速度更快、程度更高，具體表現(xiàn)為油紅O比色在分化第9天開始出現(xiàn)脂質(zhì)聚集增多(3T3-L1-mock細(xì)胞為第12天)，分化成熟標(biāo)記基因PPARγ2、C/EBPα和aP2從分

10、化第3天起上調(diào)，Leptin自分化第6天起上調(diào)，而3T3-L1-mock細(xì)胞的PPARα2和Leptin于分化第6天、C/EBPα和aP2于分化第9天才上調(diào)，且增幅較弱；對成熟脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)代謝特性的分析顯示，3T3-L1-MCHR2和3T3-L1-mock細(xì)胞在MCH作用下FFA的含量無明顯差異，而TG的含量明顯升高，升高率分別為22.61％和12.17％；ELISA法檢測成熟脂肪細(xì)胞Leptin的分泌，3T3-L1-MCHR2細(xì)胞在