Tet-on調(diào)控報(bào)告基因酪氨酸酶用于光聲、PET及MRI多模態(tài)顯像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：放射性核素標(biāo)記苯甲酰胺（benzamide, BZA）類小分子化合物具備與黑色素特異性結(jié)合的特性。本研究制備一種新型18F標(biāo)記苯甲酰胺類似物，18F-5-氟-N-(2-(二乙氨基)乙基)吡啶甲酰胺（18F-5-fluoro-N-(2-(Diethylamino)ethyl)picolinamid，并命名為18F-5-FPN，研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體顯像實(shí)驗(yàn)，評(píng)估其對(duì)惡性黑色素瘤的靶向能力和體內(nèi)代謝特點(diǎn)。
　　方法：利用GE

2、公司的FX-XN合成模塊18F-與前體5-溴-N-(2-(二乙胺基)乙基)吡啶甲酰胺（5-bromo-N-(2-(diethylamino) ethyl)picolinamide）之間發(fā)生親核取代反應(yīng)得到產(chǎn)物18F-5-FPN，通過(guò)高效液相色譜（high performance liguid chromatography,HPLC）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化及鑒定。體外培養(yǎng)小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞 B16F10（產(chǎn)生黑色素）和人惡性黑色素瘤細(xì)胞 A37

3、5m（不產(chǎn)生黑色素），利用細(xì)胞飽和、攝取及阻斷等體外實(shí)驗(yàn)探討其在體外與黑色素結(jié)合的特異性。荷B16F10瘤鼠注射顯像劑18F-5-FPN（3.7–5.55MBq）1min后，應(yīng)用小動(dòng)物正電子發(fā)射斷層掃描（micro-positron emission tomography, microPET）獲取動(dòng)態(tài)顯像圖，以研究該探針在活體內(nèi)的代謝特點(diǎn)。注射顯像劑后1、2 h，荷B16F10和A375m移植瘤裸鼠行microPET靜態(tài)顯像、生物分布實(shí)

4、驗(yàn)探討其在體內(nèi)特異性靶向黑色素的能力。荷B16F10裸鼠在18F-5-FPN PET顯像后第二天行18F-FDG PET顯像，比較兩種探針對(duì)荷B16F10瘤鼠的特異性靶向能力。B16F10肺轉(zhuǎn)移模型分別于14、21天行PET顯像，進(jìn)一步探討了18F-5-FPN對(duì)黑色素瘤肺部轉(zhuǎn)移病灶的探測(cè)能力。
　　結(jié)果：應(yīng)用FX-XN合成模塊成功標(biāo)記并純化18F-5-FPN，標(biāo)記率為5％~8%（n=5），其放化純大于95%，比活度為100~120

5、 GBq/μmol，體外穩(wěn)定性好，3 h放化純?nèi)源笥?5%。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示 B16F10細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)18F-5-FPN的攝取明顯高于A375m細(xì)胞，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中1 h細(xì)胞攝取達(dá)到峰值，分別為7.29±0.61%和1.05±0.09%(n=3)。PET動(dòng)態(tài)顯像研究顯示腫瘤部位放射性攝取隨時(shí)間逐漸增加，18F-5-FPN主要經(jīng)腎臟快速排泄。PET靜態(tài)顯像B16F10腫瘤顯示清晰，生物分布研究相應(yīng)部位1 h

6、和2 h的放射性攝取分為24.34±6.32、16.63±5.41%ID/g(n=5)，而A375m腫瘤未見(jiàn)顯影，其放射攝取值僅為1.75±0.92、0.61±0.12%ID/g。在過(guò)量標(biāo)準(zhǔn)品19F-5-FPN與18F-5-FPN共注射后，大部分器官放射性攝取率明顯低于未阻斷組，1 h腫瘤部位放射性攝取值僅為1.36±0.37%ID/g（n=4）。感興趣區(qū)定量分析發(fā)現(xiàn)18F-5-FPN探針PET顯像對(duì)應(yīng)腫瘤/背景比值明顯高于18F-FD

7、G探針，分別為35.22±7.02和3.29±0.53，前者是后者的10倍左右。18F-5-FPN探針能及時(shí)探測(cè)到B16F10肺轉(zhuǎn)移模型內(nèi)微小轉(zhuǎn)移病灶（直徑1~2 mm）。
　　結(jié)論：本研究證實(shí)了18F-5-FPN可在體內(nèi)/外特異性靶向黑色素，腫瘤部位親和力高且顯像劑滯留明顯、理想的藥代動(dòng)力學(xué)特征，可以作為一種無(wú)創(chuàng)的分子探針用于黑色素瘤早期診斷及分期。
　　目的：構(gòu)建以酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）作為報(bào)告基因的

8、Tet-on基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并以慢病毒包裝，通過(guò)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，初步探討應(yīng)用單一報(bào)告基因TYR進(jìn)行核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)、光聲顯像(photoacoustic imaging, PAI）及正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography, PET)多模態(tài)顯像的可行性。
　　方法：通過(guò)基因工程方法將TYR報(bào)告基因連接到帶有篩選標(biāo)志的Lenti-X T

9、et-on3G基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建 Tet-on慢病毒載體，然后將其轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞并通過(guò)嘌呤霉素篩選單克隆穩(wěn)定細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染后的231細(xì)胞用強(qiáng)強(qiáng)力霉素（doxorubicin, Dox）處理后被當(dāng)做陽(yáng)性細(xì)胞（命名為231-Tyr+Dox）和轉(zhuǎn)染后231細(xì)胞未用Dox處理（命名為231-Tyr）和未轉(zhuǎn)染的231細(xì)胞（命名為231）均被陰性對(duì)照組。應(yīng)用Western Blot（WB）、黑色素Masson-Fon

10、tana染色、細(xì)胞免疫熒光等實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同組細(xì)胞目的基因酪氨酸酶的表達(dá)。對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組、不同濃度的細(xì)胞進(jìn)行MRI顯像和PAI顯像。制備PET探針18F-5-氟-N-(2-(二乙氨基)乙基)吡啶甲酰胺（18F-5-fluoro-N-(2-(Diethylamino)ethyl)picolinamid，被命名為18F-5-FPN），對(duì)不同分組細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞攝取和阻斷實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：成功制備以慢病毒為載體、Tet-on調(diào)控含TYR目的基因

11、的重組系統(tǒng)，并通過(guò)轉(zhuǎn)染，篩選并培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。通過(guò)WB、Masson-Fontana染色、細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示僅有231-Tyr細(xì)胞在誘導(dǎo)劑Dox誘導(dǎo)后表達(dá)目的基因TYR。通過(guò)改變Dox孵育的劑量和時(shí)間對(duì)231-Tyr細(xì)胞黑色素產(chǎn)量進(jìn)行精確調(diào)控。黑色素產(chǎn)量與Dox濃度正相關(guān)，當(dāng)濃度為2000 ng/mL時(shí)達(dá)到飽和。MRI細(xì)胞顯像顯示231-Tyr+Dox細(xì)胞較對(duì)照組明顯縮短了T1和T2弛豫時(shí)間，且T2弛豫時(shí)間縮短程度更明顯。PAI細(xì)

12、胞顯像僅在231-Tyr+Dox細(xì)胞探測(cè)到PAI信號(hào)，且隨著細(xì)胞濃度增加而增加。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示，231-Tyr+ Dox細(xì)胞對(duì)18F-5-FPN的攝取在60 min時(shí)最高，細(xì)胞攝取值為4.80±0.16%（n=4），阻斷實(shí)驗(yàn)細(xì)胞攝取以對(duì)照組為參照其抑制率為54.7±3.34%，說(shuō)明18F-5-FPN與TYR基因產(chǎn)物黑色素特異性靶向能力。
　　結(jié)論：本研究驗(yàn)證了人TYR基因通過(guò)轉(zhuǎn)染，可在非黑色素MDA-MB-231細(xì)胞中誘導(dǎo)黑色素