PCNA反義探針用于基因顯像的實驗研究.pdf

1、目的：以放射性核素標(biāo)記針對增殖細胞核抗原(PCNA)mRNA的反義寡核苷酸，通過一系列體外和體內(nèi)實驗研究，探討該標(biāo)記物作為一種分子探針應(yīng)用于反義顯像研究的價值。 方法：分別合成一段針對PCNAmRNA5'端非編碼區(qū)的反義和正義寡核苷酸，在雙功能螯合劑S-Acetyl-NHS-MAG3的螯合作用下，以99mTc進行標(biāo)記。標(biāo)記后觀察標(biāo)記率，放射化學(xué)純度，標(biāo)記物與互補寡核苷酸的結(jié)合能力，標(biāo)記物在PBS和血清中的穩(wěn)定性；觀察該標(biāo)記物在增

2、殖旺盛的卵巢癌細胞中與靶基因特異性結(jié)合的能力和攝取動力學(xué)，研究標(biāo)記物在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布，并對荷卵巢癌裸鼠進行顯像；研究標(biāo)記物在增殖旺盛的血管平滑肌細胞中與目的基因特異性結(jié)合的能力和攝取動力學(xué)。 1.寡核苷酸的偶聯(lián)和標(biāo)記 人工合成一段針對PCNAmRNA5'端非編碼區(qū)的含18個堿基的反義寡核苷酸，相應(yīng)的正義鏈合成后用于對照實驗。在相同條件下分別對正義和反義寡核苷酸進行偶聯(lián)和標(biāo)記。在一定條件下，寡核苷酸與NHS-

3、MAG3發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，以0.7×28cmSephadexG25凝膠柱分離偶聯(lián)和游離的核酸。隨后以99mTc對偶聯(lián)物進行標(biāo)記，以0.7×28cmSephadexG25凝膠層析柱對標(biāo)記產(chǎn)物進行標(biāo)記率的分析，以反相Sep-PakC18小柱進行放射性化學(xué)純度分析。作為對照，以未偶聯(lián)MAG3的核酸按相同條件進行標(biāo)記。將標(biāo)記物與PBS和新鮮人血清在37℃條件下孵育，上樣至Sep-PakC18小柱，觀察放射性峰的漂移情況和放射化學(xué)純度。分別將標(biāo)記的正

4、義和反義核酸與互補鏈在37℃條件下共同孵育1小時，再以Sep-PakC18小柱觀察洗脫液放射性峰值漂移情況，以判斷標(biāo)記物與互補鏈的分子雜交能力。 2.標(biāo)記物對卵巢癌細胞增殖以及對目的基因表達的影響 以MTT試驗初步篩查反義探針對卵巢癌HO8910細胞的有效作用濃度；以5μM濃度的反義探針作用于HO8910細胞后，以流式細胞儀觀察細胞增殖情況；另外以RT-PCR和Western-blotting觀察一定濃度的反義、正義探針

5、對卵巢癌HO8910細胞PCNAmRNA和蛋白表達的影響。 3.標(biāo)記物在卵巢癌細胞株HO8910細胞中的攝取和清除 取卵巢癌HO8910細胞，加入標(biāo)記的反義、正義寡核苷酸后分別在37℃和22℃條件下培養(yǎng)，于不同時間進行細胞計數(shù)，檢測細胞和上清液中的放射性計數(shù)，計算細胞的攝取百分率。正義和反義探針與不同溫度下培養(yǎng)的細胞孵育達到最大攝取后更換為不含探針的培養(yǎng)液，分別在37℃和22℃條件下培養(yǎng)，于不同時間進行細胞計數(shù)，檢測細胞

6、和上清液中的放射性計數(shù)，計算細胞內(nèi)放射性滯留率。 4.標(biāo)記物在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布以及對腫瘤模型的顯像研究 取正常雌性昆明小鼠70只，分為兩組，分別經(jīng)尾靜脈注射正義和反義探針，925kBq/只，在不同的時間點眼眶取血后將動物引頸處死。取血、心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉、骨骼、卵巢、腦組織，生理鹽水沖洗后以濾紙擦干稱重，γ-計數(shù)器測各樣品和標(biāo)準(zhǔn)源放射性計數(shù)(cpm)，計算各臟器每克組織放射性占總注入放射性的百分比

7、。 取荷卵巢癌雌性裸鼠8只，隨機分為A、B、C三組。A組(n=3)和B組(n=3)分別經(jīng)尾靜脈注入18.5MBq(約10μgDNA)99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON；C組(n=2)每只尾靜脈注入非標(biāo)記的ASON10μg，2h后再注入99mTc-MAG3-ASON18.5MBq。每只動物以800～1000mg/kg體重腹腔注射20％的烏拉坦(溶解于生理鹽水)麻醉。注入顯像劑后15min，30min，1h

8、，2h，5h，10h及18h，SPECT儀后位采集圖像。以低能高分辨率準(zhǔn)直器采集，距陣256×256，能峰設(shè)置140keV窗寬20％，放大倍數(shù)為4.0，每幀采集200s。 5.標(biāo)記物對增殖的血管平滑肌細胞增殖以及對目的基因表達的影響 以MTT試驗初步篩查反義探針對增殖旺盛的血管平滑肌細胞的有效作用濃度；以5μM濃度的反義探針作用于增殖細胞后，以流式細胞儀觀察細胞增殖情況；另外以RT-PCR觀察一定濃度的反義、正義探針對血

9、管平滑肌細胞PCNAmRNA表達的影響。 6.標(biāo)記物在增殖的血管平滑肌細胞中的攝取和清除 將正義、反義探針以30ng/ml的濃度分別溶解于含10％和1％胎牛血清的DMEM中，分別加入對數(shù)生長期及平臺期大鼠主動脈平滑肌細胞，在37℃條件下孵育，檢測不同時段的攝取百分?jǐn)?shù)。根據(jù)攝取實驗結(jié)果，分別以含反義和正義PCNA寡核苷酸探針的培養(yǎng)液培養(yǎng)對數(shù)生長期和平臺期細胞，待探針達到最大攝取后更換為不含探針的培養(yǎng)液，洗滌數(shù)次后繼續(xù)培養(yǎng)，

10、分別檢測不同時間點兩種探針在細胞中的滯留率。 MTT和流式細胞儀檢測實驗表明，5μM濃度的99mTc-MAG3-ASON能顯著抑制HO8910細胞增殖，以此濃度的99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON分別作用于增殖的HO8910細胞，發(fā)現(xiàn)前者能顯著減低細胞PCNAmRNA和蛋白的表達。 37℃條件下，卵巢癌細胞HO8910對99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON的攝取均于60mi

11、n時達到高峰，前者峰值明顯高于后者，分別為25.51％±3.56％和12.34％±2.45％，(P＜0.01，n=4)。22℃條件下，細胞對ASON和SON的攝取峰時為120min，峰值無明顯差異。37℃和22℃條件下，240min時99mTc-MAG3-ASON在HO8910細胞內(nèi)的滯留高于99mTc-MAG3-SON。22℃條件下，兩種探針在HO8910細胞中的清除速度均明顯低于37℃。 99mTc-MAG3-ASON和99

12、mTc-MAG3-SON在正常昆明小鼠體內(nèi)的時間生物學(xué)分布情況一致。放射性物質(zhì)主要經(jīng)腎臟和腸道排泄，早期放射性藥物主要分布于血液、肝臟和腎臟，隨著時間延長，肝臟、腎臟和血液中的放射性逐漸下降，腸道中的放射性分布逐漸濃聚，3h以后腸道放射性分布呈緩慢減低趨勢。但12h時，腸道放射性分布相對于6h上升，此時放射性主要分布于肝臟、腸道和血液。在整個過程中，卵巢、肌肉、骨骼、腦組織、肺和脾臟的放射性分布較低，隨時間推移緩慢減低。 注射9

13、9mTc-MAG3-ASON后30min，腫瘤部位開始出現(xiàn)放射性濃集，60min時腫瘤部位放射性濃聚最明顯，此時肝臟、膀胱及腸道亦可見放射性濃集，上腹部本底偏高，對側(cè)肢體相應(yīng)部位以及上肢和頭胸部顯像劑分布稀疏，T/NT=3.01±0.35(n=3)。隨后腫瘤組織放射性分布呈減低趨勢，但清除緩慢。至注射反義探針后10h，腹部放射性分布明顯減低，頭頸部及未接種腫瘤的肢體部位放射性分布明顯減低，腫瘤部位顯影逐漸清晰，此時顯像劑主要分布于腸道和

14、腫瘤部位，此時的T/NT=4.10±0.28(n=3)。在所有時間點，注射99mTc-MAG3-SON組和阻斷組腫瘤裸鼠腫瘤部位的放射性濃聚均較反義組低。 MTT和流式細胞儀檢測實驗表明，5μM濃度的99mTc-MAG3-ASON可以顯著抑制細胞增殖。與99mTc-MAG3-SON相比，99mTc-MAG3-ASON可以顯著減低增殖的血管平滑肌細胞PCNAmRNA的表達。 99mTc-MAG3-ASON在對數(shù)生長期平滑肌

15、細胞中的攝取顯著高于99mTc-MAG3-SON，但在平臺期細胞中兩者的攝取無顯著差異，99mTc-MAG3-ASON在對數(shù)期細胞中的攝取高于平臺期細胞。240min時，99mTc-MAG3-ASON在對數(shù)生長期細胞中的滯留(79.6％±0.96％)高于99mTc-MAG3-SON(59.8％±0.75％)，P＜0.05，n=4。平臺期兩種探針的清除無顯著差異。 結(jié)論：在雙功能螯合劑S-Acetyl-NHS-MAG3的作用下，9