探針熔解曲線分析應(yīng)用于丙型肝炎病毒的基因分型.pdf

1、病毒基因型是丙型肝炎抗病毒治療方案選擇的重要依據(jù),常見(jiàn)的分型方法有測(cè)序分析、反向線性雜交、實(shí)時(shí)熒光PCR等,不同的方法設(shè)計(jì)各有優(yōu)勢(shì)和不足,本文建立了一個(gè)熒光PCR結(jié)合熔解曲線分析的丙型肝炎病毒(Hepatitis CvirUS,HCV)分型體系,用以區(qū)分中國(guó)大陸較常見(jiàn)的HCV1a、1b、2a、3a、3b、6a亞型。
　　 實(shí)驗(yàn)方法如下:
　　 一、制備6個(gè)內(nèi)含HCV RNA核心區(qū)核酸序列的病毒樣顆粒(HCV假病毒),分別

2、作為6個(gè)HCV亞型的替代物/陽(yáng)性質(zhì)控品;
　　 二、設(shè)計(jì)通用引物擴(kuò)增出HCV基因組的核心區(qū),并設(shè)計(jì)熒光探針與各HCV亞型擴(kuò)增子雜交,使之得到亞型特異的熔點(diǎn);
　　 三、考察和優(yōu)化體系的分型能力;
　　 四、建立從RNA提取到PCR產(chǎn)物分析的檢測(cè)流程,進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、制各的6個(gè)HCV假病毒分別包裹了6個(gè)HCV亞型基因組核心區(qū)序列,且耐受核酸酶降解;
　　 二、通用

3、引物可成功擴(kuò)增出6個(gè)HCV亞型基因組核心區(qū)序列,設(shè)計(jì)的兩條熒光探針與各亞型序列雜交,可得到亞型特異的熔點(diǎn),從而能夠準(zhǔn)確區(qū)分6個(gè)HCV亞型(在探針檢測(cè)區(qū)有突變的病毒株除外);
　　 三、分型體系的檢測(cè)靈敏度1a、1b、2a、3b和6a達(dá)到50拷貝RNA,3a達(dá)到500拷貝RNA,對(duì)于1b和2a亞型雙重感染,當(dāng)兩者RNA比例在1:95到95:1之間時(shí)可以檢出;
　　 四、用本方法檢測(cè)由假病毒摻入陰性血清制成的模擬樣本,1a、