病毒載體應(yīng)用于基因治療

1、病毒載體應(yīng)用于基因治療,病毒載體概述,要求：1、攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒 2、介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達(dá) 3、對(duì)機(jī)體不致病,容量：自身基因組大小的105%-110%,,,組成：1、病毒復(fù)制和包裝元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外殼/外膜,用途：基因轉(zhuǎn)移和表達(dá) 1、基因治療

2、 2、疫苗 3、器官移植 4、組織工程 5、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 6、基因功能研究,直接體內(nèi)法(in vivo),間接體內(nèi)法(ex vivo),病毒載體的靶向性,轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性,轉(zhuǎn)錄靶向性（特異性）,,,,,改造病毒外殼/外膜,連接靶向性結(jié)合分子,,Modified virus,,,,,,,cell,,,,,組織特異性啟動(dòng)子,腫瘤選擇性啟動(dòng)子,細(xì)胞周期調(diào)控啟動(dòng)子,腫瘤血管內(nèi)皮導(dǎo)向啟動(dòng)子,雙特異性啟動(dòng)子,,,,,病毒

3、增殖的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控,逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)結(jié)構(gòu),逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)是RNA病毒，它有三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因： env-編碼gpl20和gp41兩種包膜糖蛋白；gag-編碼病毒衣殼、基質(zhì)等結(jié)構(gòu)蛋白的基因；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(p66/p51)、蛋白水解酶和整合酶。,逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期進(jìn)入宿主細(xì)胞 雙鏈RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 雙鏈DNA前病毒 整合到宿

4、主細(xì)胞基因組DNA中 宿主細(xì)胞RNA聚合酶II mRNA 病毒RNA基因組 作為合成相應(yīng) 病毒蛋白質(zhì)的模板 包裝成新的病毒顆粒，離開宿主,,,,,,,,,,LTR,gag,pol,env,φ,LTR,長末端重復(fù)序列,調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生病毒核心蛋白,產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶,產(chǎn)生病毒外膜蛋白,包裝信號(hào),DNA前病毒

5、的結(jié)構(gòu)特征,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建,常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)構(gòu)建的 各類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。,LTR,gag,pol,env,φ,LTR,長末端重復(fù)序列,調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,包裝信號(hào),目的基因,標(biāo)記基因,,LTR,gag,pol,env,LTR,,Gag蛋白,,PoL蛋白,Env蛋白,,包裝細(xì)胞系,,LTR,LTR,靶細(xì)胞,目的基因,標(biāo)記基因,LTR,φ,LTR,目的基因,標(biāo)記基因,,,,,,,,,1,2,3,4,5,假

6、病毒顆粒的產(chǎn)生并感染靶細(xì)胞,,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(核酸部分只能是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體),輔病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體應(yīng)用實(shí)例,Stage-20 G3 embryos,Stage-28 G3 embryos,腺病毒(Adenovirus)結(jié)構(gòu),腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，衣殼（capsid）呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑約80-110nm。衣殼含有240個(gè)六聯(lián)體（hexon）、

7、12個(gè)五聯(lián)體（penton）和12根纖毛（fiber）。五聯(lián)體（penton）和纖毛的頭節(jié)區(qū)（knob）可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。,knob,腺病毒感染通路,1.結(jié)合細(xì)胞表面受體2.內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞3.轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核 4.釋放病毒DNA,腺病毒載體應(yīng)用實(shí)例(1),中國科學(xué)院生化研究所劉新垣院士提出了癌癥的靶向雙基因病毒治療策略，用重組腺病毒ZD55-MnSOD和重組

8、腺病毒ZD55-TRAIL聯(lián)合治療人結(jié)腸直腸癌。并且該腺病毒EIA基因自身的啟動(dòng)子被hTERT啟動(dòng)子所取代，使得該重組腺病毒變成一種依賴端粒酶的條件復(fù)制型增殖病毒。MnSOD(Manganese superoxide dismutase):is a latent tumor suppressor gene. TRAIL:Tumor necrosis factor–related apoptosis-inducing ligand

9、genes。ZD55-TRAIL was shown to induce the MnSOD expression in SW620 cells.,a, without adenoviral transduction;b, transduced with ZD55-MnSOD;c, transduced with ZD55-TRAIL; d, transduced with the combination of ZD55-Mn

10、SOD with ZD55-TRAIL.,腺病毒載體應(yīng)用實(shí)例(2),Her2 (human epidermalgrowth factor receptor-2)：原癌基因人類表皮生長因子受體基因, 是一種人癌細(xì)胞表面的biomarker。,DARPin(Designed ankyrinrepeat protein),,,Target,Her2,,其他病毒載體-巨細(xì)胞病毒載體,Animal: Rhesus macaques SIV: