P125A突變型endostatin應(yīng)用于腫瘤基因治療研究的初探.pdf

1、腫瘤血管靶向性的抗腫瘤治療，日益受到人們的關(guān)注。Endostatin是目前比較看好的一種內(nèi)源性抗血管生成的抑制因子。大量的研究數(shù)據(jù)表明它在體內(nèi)體外實驗中，具有很強的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用，最近的研究表明帶有P125A的endostatin有更強的黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，而且有更高的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的效率。 目的：評價和比較外源野生型內(nèi)皮抑素(wild endostatin,wES)和突變型內(nèi)皮抑素(mutant en

2、dostatin，mES；P125A)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的效率，為人源基因載體開展腫瘤的血管靶向基因治療提供實驗依據(jù)。 方法：PCR定點誘變法獲取mES(P125A)；構(gòu)建pcDNA3.1/wES和pcDNA3.1/mES載體，瞬時轉(zhuǎn)染Bel-7402肝癌細(xì)胞系，利用ELISA檢測wES和mES的表達(dá)情況；篩選和建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bel-7402肝癌細(xì)胞株，收集含有ES的細(xì)胞上清培養(yǎng)液作為HUVEC的條件培養(yǎng)基，MTT試驗和流式細(xì)

3、胞儀檢測wES和mES對HUVEC的增殖和凋亡的影響。構(gòu)建攜帶EF-1α啟動子的分泌型重組體phrneo/mES，電轉(zhuǎn)Bel-7402細(xì)胞，G418篩選和RT-PCR鑒定穩(wěn)定表達(dá)克隆，ELISA檢測mES的表達(dá)情況。 結(jié)果：測序結(jié)果顯示獲得了包含全長的mES(P125A)，共624bp：構(gòu)建的pcDNA3.1/wES和pcDNA3.1/mES瞬時轉(zhuǎn)染bel-7402肝癌細(xì)胞24小時后的ES次表達(dá)量分別為18.57±2.39 ng

4、/ml和17.78±2.74ng/ml，無顯著性差異；穩(wěn)定克隆培養(yǎng)上清液能獲得的10<'2>ng/ml級的ES，500ng/ml的wES和mES對于HUVEC增殖的抑制率分別為41.4％和64.0％，誘導(dǎo)凋亡的效率分別為13.0％和32.7％，均有顯著性差異。成功構(gòu)建的phrneo/mES，獲得了24個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，mES表達(dá)量為15-20ng/10<'6>細(xì)胞/24h。 結(jié)論：(1)獲得了P125A突變型ES；(2)wES和m