基因治療用于半月板損傷的實驗研究.pdf

1、半月板是膝關(guān)節(jié)內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)，對于維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定、潤滑關(guān)節(jié)和防止關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性變起著重要作用。隨著運動性損傷發(fā)生率的上升，半月板損傷病例在臨床上也越來越多見。由于半月板僅外緣部分有血液供應(yīng)，中央部分游離緣沒有血液供應(yīng)，故半月板損傷后，尤其是中央游離緣部分損傷后，半月板自行愈合的能力較差。目前針對半月板損傷所考慮的治療方案有半月板縫合術(shù)，半月板切除術(shù)，組織工程半月板修補術(shù)或移植術(shù)，異體半月板移植術(shù)等。臨床上較早同時也是較多應(yīng)用的治療方法為

2、半月板切除術(shù)，但越來越多的研究顯示半月板切除會加速關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，使骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率上升。組織工程半月板和異體半月板移植研究工作的開展給治療半月板損傷提供了新的方法，但仍有許多問題亟待解決：如何維持組織工程半月板種子細胞的穩(wěn)定性，種子細胞附著材料的選擇，如何提高異體半月板移植的愈合等等。隨著新興的基因治療技術(shù)廣闊應(yīng)用前景的展現(xiàn)，運用該技術(shù)治療半月板損傷的新的治療嘗試也被期待著出現(xiàn)有益結(jié)果。本課題即是應(yīng)用基因治療技術(shù)，通過觀察克隆有

3、特定生長因子基因的重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染半月板纖維軟骨細胞，觀察半月板纖維軟骨細胞對生長因子基因轉(zhuǎn)染的反應(yīng)，以期對發(fā)現(xiàn)治療半月板損傷的有效方法有進一步的認識。本課題由四個部分組成。 第一部分、半月板細胞的分離與培養(yǎng) 目的：探討分離培養(yǎng)半月板纖維軟骨細胞的有效方法和效能；觀察體外培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細胞的生物學特點。 材料與方法：嚴格無菌環(huán)境下切取新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)半月板，洗滌后剪碎，先后用胰酶(O.25％)和膠原酶(

4、O.3％)進行消化，然后過濾離心，細胞沉淀重懸后檢查細胞存活率，進行原代細胞培養(yǎng)和傳代。記錄細胞生長數(shù)量，細胞增殖，細胞周期和膠原合成情況。 結(jié)果：分離的半月板纖維軟骨細胞存活率大于95％，半月板細胞體外培養(yǎng)生長良好，傳代順利，可以傳至6代以上。 結(jié)論：應(yīng)用胰酶、膠原酶聯(lián)合消化法能成功分離出半月板纖維軟骨細胞，分離的半月板細胞體外培養(yǎng)時能正常生長，保持纖維軟骨細胞的特性。 第二部分、攜帶bFGF基因的重組慢病毒載

5、體的構(gòu)建 目的：探討構(gòu)建攜帶特定生長因子基因的重組慢病毒載體的有效方法。 材料與方法：利用RT—PCR反應(yīng)從組織中獲得堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)基因CDNA全長，與真核表達質(zhì)粒pLenti6／V5-D-TOPO進行連接。將連接后的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中進行擴增。隨后，將連接后的重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)?；旌弦黄鹪?93細胞液進行重組慢病毒的構(gòu)建，檢測構(gòu)建的慢病毒載體。 結(jié)果：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測所擴增的bFGF基因

6、cDNA條帶，利用直接測序法驗證bFGF基因與真核表達質(zhì)粒pLenti6／V5-D-TOPO正確連接，重組慢病毒載體構(gòu)建成功。結(jié)論：bFGF基因能有效地與真核表達質(zhì)粒pLenti6／V5-D-TOPO進行連接，連接后的質(zhì)?？梢院桶b質(zhì)粒成功構(gòu)建重組慢病毒。 第三部分、重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染單層培養(yǎng)的半月板細胞 目的：觀察重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染分離培養(yǎng)的單層半月板細胞的效能以及半月板細胞對bFGF基因轉(zhuǎn)染的反應(yīng)。材料與方法：當?shù)谝?/p>

7、代半月板細胞培養(yǎng)到60％融合時，洗滌后與重組慢病毒載體懸液共培養(yǎng)。同時設(shè)立對照組和空白組，對照組是與單純慢病毒共培養(yǎng)后的半月板纖維軟骨細胞；空白組是未經(jīng)任何特殊處理的半月板纖維軟骨細胞。檢測各組半月板纖維軟骨細胞的細胞增殖、細胞周期和膠原合成情況。 結(jié)果：與重組慢病毒載體懸液共培養(yǎng)48h后，半月板纖維軟骨細胞培養(yǎng)液中可以檢測到bFGF的表達，細胞增殖和膠原合成能力明顯高于對照組和空白組細胞(P<0.01)。 結(jié)論：克隆有

8、bFGF基因的重組慢病毒載體能有效轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的單層半月板纖維軟骨細胞，促進細胞增殖和膠原合成。 第四部分、重組慢病毒載體預(yù)處理待移植的半月板 目的：探討異體半月板移植的作用及改善異體半月板移植預(yù)后的方法。 材料與方法：以新西蘭大白兔為實驗動物，將構(gòu)建的克隆有bFGF基因的重組慢病毒載體與完整的半月板共培養(yǎng)后進行異體移植。同時設(shè)立對照組和空白組，對照組為移植未與重組滿病毒懸液共培養(yǎng)的半月板，空白組為半月板缺失組。在移

9、植術(shù)后第2、4、8、16周分別從實驗組、對照組及空白組采集移植的半月板及關(guān)節(jié)軟骨，進行組織學切片觀察移植半月板的愈合情況、半月板下關(guān)節(jié)軟骨的變化；用透射電鏡觀察細胞。并對移植的半月板標本進行免疫組化檢測和生物力學檢測。 結(jié)果：與重組慢病毒共培養(yǎng)后的半月板移植后與比鄰關(guān)節(jié)囊愈合時間提前，移植后4周就出現(xiàn)愈合，而對照組移植后8周才出現(xiàn)愈合；接受重組慢病毒預(yù)處理的半月板的生物力學強度高于對照組(P

10、膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)隨時間延長愈發(fā)明顯的退行性改變。 結(jié)論：異體半月板移植能有效防止半月板缺失膝關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，bFGF基因轉(zhuǎn)染能促進異體半月板移植的愈合，改善異體半月板移植的預(yù)后。 通過本課題的研究，我們發(fā)現(xiàn)慢病毒載體能有效地將bFGF基因轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細胞；bFGF基因轉(zhuǎn)染能促進半月板纖維軟骨細胞的增殖和膠原合成功能。異體半月板移植能有效防止關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變；bFGF基因轉(zhuǎn)染能改善異體半月板移植