突變型FoxO1基因的體外和體內(nèi)表達(dá)研究.pdf

1、代謝障礙綜合征包括肥胖癥、糖尿病、高血壓和心腦疾病等，嚴(yán)重危害著人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1(forkhead box O1)參與的瘦素抵抗在代謝障礙綜合征的發(fā)生機(jī)制中具有重要的地位，F(xiàn)oxO1與其靶基因的相互作用就成為能量代謝領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)之一。FoxO1可以作用于神經(jīng)肽基因前黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(Pro-opiomelanocortin，POMC)的啟動(dòng)子上，抑制POMC基因的轉(zhuǎn)錄，從而阻斷瘦素的信號(hào)通路，影響動(dòng)物的能量代謝。為了研

2、究DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA Binding Domain，DBD)在FoxO1功能中所起的作用，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了敲除DBD的突變體，構(gòu)建成質(zhì)粒pCMV5-Myc-FoxO1Δ4-5(pFΔ4-5)。在此基礎(chǔ)上，本論文開(kāi)展了此突變體的體內(nèi)體外表達(dá)及其功能驗(yàn)證試驗(yàn)。首先，我們將pFΔ4-5進(jìn)行擴(kuò)增、酶切分析和序列測(cè)定;然后將相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293Rb細(xì)胞（含瘦素受體的293細(xì)胞），western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞中有蛋白表達(dá)，表明該表達(dá)

3、載體構(gòu)建成功;進(jìn)一步的熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1能夠明顯地抑制POMC啟動(dòng)子的活性，而缺失了DBD的FΔ4-5不但喪失了抑制作用，反而明顯地增強(qiáng)了POMC啟動(dòng)子的活性，表明DBD是FoxO1發(fā)揮抑制所必需的;最后，將突變體基因進(jìn)行顯微注射獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。將所得的6個(gè)F0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配繁育，基因型鑒定結(jié)果表明6個(gè)F0轉(zhuǎn)基因小鼠的子代中均存在陽(yáng)性，表明FΔ4-5已整合至轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中。然后，選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)基

4、因小鼠，對(duì)其各組織中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，western blot的結(jié)果顯示目的蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠的下丘腦、肝、白色脂肪、棕色脂肪、脾、心、肺、腎等組織中均未表達(dá)，說(shuō)明FΔ4-5雖然整合至轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組中，但卻發(fā)生了基因沉默現(xiàn)象。為了明確目的基因是否是因?yàn)榘l(fā)生了啟動(dòng)子甲基化而導(dǎo)致了基因表達(dá)抑制，我們進(jìn)一步應(yīng)用亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟基因組DNA中CMV啟動(dòng)子的甲基化情況，結(jié)果顯示CMV啟動(dòng)子上的7個(gè)CpG位點(diǎn)均發(fā)生了較

5、高程度的甲基化，證實(shí)了我們的推測(cè)。隨后將不同劑量的地西他濱（5-aza-2deoxycytidine，5-aza）對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，進(jìn)行CMV啟動(dòng)子的去甲基化研究。CMV啟動(dòng)子甲基化分析和目的蛋白的western blot結(jié)果顯示，在注射5-aza后，雖然有去甲基化現(xiàn)象的發(fā)生，但目的蛋白仍未表達(dá)。結(jié)論:1.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明DBD是FoxO1分子中抑制POMC啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域;2.CMV啟動(dòng)子控制突變型FoxO1基因在293Rb細(xì)