版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、代謝障礙綜合征包括肥胖癥、糖尿病、高血壓和心腦疾病等,嚴(yán)重危害著人類的健康。研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)oxO1(forkhead box O1)參與的瘦素抵抗在代謝障礙綜合征的發(fā)生機(jī)制中具有重要的地位,F(xiàn)oxO1與其靶基因的相互作用就成為能量代謝領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)之一。FoxO1可以作用于神經(jīng)肽基因前黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(Pro-opiomelanocortin,POMC)的啟動(dòng)子上,抑制POMC基因的轉(zhuǎn)錄,從而阻斷瘦素的信號(hào)通路,影響動(dòng)物的能量代謝。為了研
2、究DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA Binding Domain,DBD)在FoxO1功能中所起的作用,實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了敲除DBD的突變體,構(gòu)建成質(zhì)粒pCMV5-Myc-FoxO1Δ4-5(pFΔ4-5)。在此基礎(chǔ)上,本論文開(kāi)展了此突變體的體內(nèi)體外表達(dá)及其功能驗(yàn)證試驗(yàn)。首先,我們將pFΔ4-5進(jìn)行擴(kuò)增、酶切分析和序列測(cè)定;然后將相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293Rb細(xì)胞(含瘦素受體的293細(xì)胞),western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞中有蛋白表達(dá),表明該表達(dá)
3、載體構(gòu)建成功;進(jìn)一步的熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明,F(xiàn)oxO1能夠明顯地抑制POMC啟動(dòng)子的活性,而缺失了DBD的FΔ4-5不但喪失了抑制作用,反而明顯地增強(qiáng)了POMC啟動(dòng)子的活性,表明DBD是FoxO1發(fā)揮抑制所必需的;最后,將突變體基因進(jìn)行顯微注射獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。將所得的6個(gè)F0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配繁育,基因型鑒定結(jié)果表明6個(gè)F0轉(zhuǎn)基因小鼠的子代中均存在陽(yáng)性,表明FΔ4-5已整合至轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中。然后,選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)基
4、因小鼠,對(duì)其各組織中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),western blot的結(jié)果顯示目的蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠的下丘腦、肝、白色脂肪、棕色脂肪、脾、心、肺、腎等組織中均未表達(dá),說(shuō)明FΔ4-5雖然整合至轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組中,但卻發(fā)生了基因沉默現(xiàn)象。為了明確目的基因是否是因?yàn)榘l(fā)生了啟動(dòng)子甲基化而導(dǎo)致了基因表達(dá)抑制,我們進(jìn)一步應(yīng)用亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟基因組DNA中CMV啟動(dòng)子的甲基化情況,結(jié)果顯示CMV啟動(dòng)子上的7個(gè)CpG位點(diǎn)均發(fā)生了較
5、高程度的甲基化,證實(shí)了我們的推測(cè)。隨后將不同劑量的地西他濱(5-aza-2deoxycytidine,5-aza)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射,進(jìn)行CMV啟動(dòng)子的去甲基化研究。CMV啟動(dòng)子甲基化分析和目的蛋白的western blot結(jié)果顯示,在注射5-aza后,雖然有去甲基化現(xiàn)象的發(fā)生,但目的蛋白仍未表達(dá)。結(jié)論:1.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明DBD是FoxO1分子中抑制POMC啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域;2.CMV啟動(dòng)子控制突變型FoxO1基因在293Rb細(xì)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2058.突變型foxo1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表達(dá)及表型分析
- 脫氧核酶抑制突變型p53基因表達(dá)的體外研究.pdf
- 野生型基因突變成為突變型基因
- 豬FoxO1基因cDNA的克隆及其組織表達(dá)研究.pdf
- 突變型DJ-1蛋白對(duì)細(xì)胞線粒體功能、基因表達(dá)譜的影響和AREP基因型與表型分析.pdf
- 突變型PS-1對(duì)RA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞基因差異表達(dá)的影響.pdf
- 人MBL的突變型哺乳細(xì)胞表達(dá)和野生型原核表達(dá)的研究.pdf
- 野生型及c.454ct突變型人vegfa基因重組真核表達(dá)載體的體外構(gòu)建及表達(dá)研究
- A39S突變型DJ-1蛋白對(duì)基因表達(dá)譜的影響及DJ-1基因突變檢測(cè)和血清DJ-1蛋白檢測(cè)分析.pdf
- 51919.t42m突變型epsp合成酶基因的克隆和研究
- 突變型與野生型tnf
- 冠心病相關(guān)基因MEF2A的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及其突變型真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外活性研究.pdf
- 突變型hGM-CSF基因的克隆及其在甲醇酵母(pichia pastoris)中表達(dá)的研究.pdf
- 普通牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的克隆、表達(dá)及其對(duì)肉質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)分析.pdf
- 人野生型和突變型CITED2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá).pdf
- miR-25對(duì)擴(kuò)展突變型ATXN3的表達(dá)調(diào)控.pdf
- 豬FoxO1和SOCS3基因的表達(dá)規(guī)律及白藜蘆醇對(duì)其表達(dá)調(diào)控的影響.pdf
- 突變型P53和CyclinD1蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)的意義.pdf
- FoxO1調(diào)控鵝顆粒細(xì)胞脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)研究.pdf
- 散發(fā)性結(jié)直腸癌、腺瘤組織中hMLH1和突變型p53表達(dá)的研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論