突變型DJ-1蛋白對(duì)細(xì)胞線粒體功能、基因表達(dá)譜的影響和AREP基因型與表型分析.pdf

1、第一部分突變型DJ-1蛋白對(duì)細(xì)胞線粒體功能和基因組表達(dá)譜的影響DJ-1基因是常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征(autosomal recessive early-onset parkinsonism，AREP)的致病基因之一，目前在PD發(fā)病機(jī)制中的作用仍不清楚。前期工作中，本研究小組發(fā)現(xiàn)一種新的DJ-1基因突變-L10P。為探討DJ-1基因的L10P突變?cè)谂两鹕?Parkinson’s disease，PD)發(fā)病機(jī)制中的作用，我們從

2、以下3個(gè)方面進(jìn)行了研究： 1.應(yīng)用G418進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)pCMV-Tag 2A-Flag、pCMV-Tag2A-Flag-DJ-1、pCMV-Tag 2A-Flag-DJ-1-L10P的HEK293單克隆細(xì)胞株的篩選，并在DNA、RNA和蛋白質(zhì)三個(gè)水平上進(jìn)行鑒定，證實(shí)獲得穩(wěn)定表達(dá)空載體、野生型DJ-1蛋白、L10P突變型DJ-1蛋白的HEK293單克隆細(xì)胞株。 2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀、分光光度計(jì)、電鏡等技術(shù)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)空載體、野

3、生型DJ-1蛋白、L10P突變型DJ-1蛋白的HEK293單克隆細(xì)胞株的生長活力、活性氧、膜電位、線粒體復(fù)合體酶Ⅰ活性及線粒體形態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空載體組相比較，L10P突變型DJ-1組細(xì)胞內(nèi)活性氧增高，細(xì)胞活力、膜電位、線粒體復(fù)合體Ⅰ活性降低，線粒體含量減少，出現(xiàn)線粒體腫脹，甚至線粒體空泡變性，特別是在魚藤酮的誘導(dǎo)下更明顯；野生型DJ-1組細(xì)胞內(nèi)野生型DJ-1組中活性氧均較低，細(xì)胞活力、膜電位、線粒體復(fù)合體Ⅰ活性均較高，特別是在魚

4、藤酮的誘導(dǎo)下更明顯，提示LlOP突變型DJ-1蛋白存在細(xì)胞毒性作用，喪失了野生型DJ-1蛋白的抗氧化應(yīng)激能力，并對(duì)線粒體的正常功能存在影響。 3.為明確L10P突變型DJ-1蛋白是否可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的變化導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)異常而參與PD的發(fā)病機(jī)制，我們應(yīng)用基因表達(dá)微珠芯片對(duì)穩(wěn)定表達(dá)空載體、野生型DJ-1蛋白、L10P突變型DJ-1蛋白的HEK293單克隆細(xì)胞株進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空載體組比較，野生型DJ-1組有14

5、個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，28個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；L10P突變型DJ-1組有14個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，9個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。L10P突變型DJ-1組與野生型型DJ-1組比較發(fā)現(xiàn)有59個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，27個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)差異基因分別參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期、蛋白修飾、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程，提示L10P突變型DJ-1蛋白可能通過直接或間接方式對(duì)這些差異基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而影響這些通路的正常功能，參與PD的發(fā)病

6、機(jī)制。 第二部分常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征基因型與表型分析AREP有3種基因型(PARK2、PARK6和PARK7)，致病基因分別是：parkin、PINK1和DJ-1基因。為探討AREP的基因型與表型是否相關(guān)，我們從以下3個(gè)方面進(jìn)行了研究： 1.建立了應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)parkin基因外顯子重排突變的技術(shù)平臺(tái)和應(yīng)用DNA直接測(cè)序檢測(cè)ATP13A2基因突變的技術(shù)平臺(tái)，完善了30個(gè)AREP家系的park

7、in、PINK1、DJ-1和ATP13A2基因的突變分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該組AREP家系中parkin、PINK1、DJ-1和ATP13A2基因的突變率分別為46.7％、6.7％、3.3％、0％，而PINK1和DJ-1雙基因突變的頻率為3.3％。 2.分別對(duì)一個(gè)攜帶parkin、PINK1、DJ-1基因突變的AREP家系進(jìn)行以11C-CFT標(biāo)記多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的PET分析，發(fā)現(xiàn)所有的患者多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體顯像信號(hào)明顯減低，與臨床癥狀嚴(yán)重程