DJ-1基因表達(dá)分析與功能研究及構(gòu)建在多巴胺能神經(jīng)元過(guò)表達(dá)tTA的基因敲入小鼠.pdf_第1頁(yè)
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1、帕金森病(Parkinson's disease,PD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病。在60歲以上人群中,其發(fā)病率約為1%,在80歲以上人群中這一數(shù)據(jù)上升至4%。帕金森病臨床上的主要特征是運(yùn)動(dòng)功能損傷,例如運(yùn)動(dòng)遲緩、震顫、肌肉僵直、步態(tài)異常和姿勢(shì)不穩(wěn)。帕金森病在病理學(xué)上的主要特征是路易小體形成和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失。最近取得的研究進(jìn)展極大的增強(qiáng)了對(duì)帕金森病的理解和認(rèn)識(shí),這將為帕金森病的治療提供理論依據(jù)。而人類(lèi)遺傳學(xué)

2、方面的研究進(jìn)展則使得我們能夠鑒定與家族性帕金森病相關(guān)的致病基因,DJ-1就是通過(guò)遺傳學(xué)連鎖分析發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)家族性PD致病基因,這些重要的發(fā)現(xiàn)為我們研究帕金森病的致病機(jī)理及治療帕金森病奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
   DJ-1屬于ThiJ/PfpI蛋白超家族,DJ-1蛋白在各個(gè)物種中比較保守,小鼠DJ-1與人DJ-1的同源性高達(dá)90%。DJ-1基因位于人染色體1p36,全長(zhǎng)24kb,共有7個(gè)外顯子,其中外顯子1A和1B不參與編碼蛋白質(zhì),并

3、且具有兩種剪接方式,2-7號(hào)外顯子包含開(kāi)放閱讀框,其編碼區(qū)全長(zhǎng)567bp,編碼含有189個(gè)氨基酸殘基、分子量約20kD的DJ-1蛋白。DJ-1基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致帕金森病的發(fā)生到目前為止仍不清楚。但越來(lái)越多的證據(jù)表明DJ-1基因可能在氧化應(yīng)激、線粒體損傷、泛素蛋白酶體系統(tǒng)以及mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)控中發(fā)揮作用。DJ-1是作為原癌基因被發(fā)現(xiàn)的,而且被證明具有氧化應(yīng)激感應(yīng)器的功能。Northern雜交分析表明,DJ-1mRNA廣泛表達(dá),存在于人

4、體各個(gè)組織中,包括腦、心、肝、胰腺、腎、骨骼肌、胎盤(pán)中,提示DJ-1具有廣泛的功能。已有研究小組對(duì)DJ-1基因在人腦及嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦中的表達(dá)模式做了分析,但是他們的研究結(jié)果存在很大的爭(zhēng)議,其中主要的爭(zhēng)議在于DJ-1基因是表達(dá)于神經(jīng)元中,還是表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中,并且DJ-1基因是否表達(dá)于多巴胺能神經(jīng)元中。在人腦中,爭(zhēng)議的焦點(diǎn)在于DJ-1基因是表達(dá)在神經(jīng)元中還是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。在嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦中,DJ-1是否表達(dá)于黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元中仍存在

5、爭(zhēng)議。
   利用DJ-1基因敲除小鼠作為陰性對(duì)照,我們研究了DJ-1在成年小鼠大腦中的表達(dá)模式和功能。通過(guò)原位雜交和免疫組化技術(shù)相結(jié)合,我們?cè)诮?jīng)過(guò)DJ-1原位雜交的玻片上進(jìn)行了TH、NeuN和GFAP的免疫組化實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)DJ-1 mRNA在超過(guò)96%的神經(jīng)元里表達(dá),而在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中沒(méi)有DJ-1mRNA的表達(dá)。黑質(zhì)的所有多巴胺能神經(jīng)元均表達(dá)DJ-1mRNA。值得一提的是,脈絡(luò)叢和室管膜上皮細(xì)胞高表達(dá)DJ-1 mRNA。DJ

6、-1廣泛的表達(dá)模式提示我們DJ-1具有一些基本的功能。隨后通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白也不存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),而令人驚奇的是,DJ-1蛋白質(zhì)不存在于神經(jīng)元內(nèi),而且DJ-1的染色是彌漫性的。我們根據(jù)已有的證據(jù)推測(cè)DJ-1是通過(guò)神經(jīng)元軸突運(yùn)輸并分泌到細(xì)胞外的,通過(guò)軸突運(yùn)輸抑制劑colchicine處理,DJ-1積累在神經(jīng)元內(nèi)。小鼠腦脊液中檢測(cè)到了DJ-1的存在。另外大量的DJ-1在小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元的培養(yǎng)基中檢測(cè)到,這些實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè)。
   多巴胺能神經(jīng)元變性死亡和功能異常被認(rèn)為是帕金森病發(fā)病的主要原因,多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)因子和風(fēng)險(xiǎn)因子的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,但是到目前為止,我們很難在動(dòng)物體內(nèi)闡明這些因子的作用。在這一方面,我們已經(jīng)取得了一些研究進(jìn)展,就是在多巴胺能神經(jīng)元中特異的敲除感興趣的基因。在過(guò)去的幾年時(shí)間里,我們致力于研究在一種可調(diào)控的模式下,在多巴胺能神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)任意一個(gè)感興趣的基因?;谶@些前期研究,我們計(jì)劃利用一種

8、新的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo),這個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本思想是將一個(gè)正反饋?zhàn)饔迷虼虬械蕉喟桶纺苌窠?jīng)元特異性的啟動(dòng)子之后,從而實(shí)現(xiàn)選擇性的在多巴胺能神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)感興趣的基因,這個(gè)正反饋?zhàn)饔迷⒆鳛閿U(kuò)增子來(lái)促進(jìn)目的基因的大量表達(dá)。正反饋?zhàn)饔迷⒗秒p向的tetO啟動(dòng)子,并作為擴(kuò)增子加速轉(zhuǎn)基因的表達(dá),多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(dopamine transporter,DAT)啟動(dòng)子將控制基因表達(dá)的特異性,我們希望此設(shè)計(jì)可以實(shí)現(xiàn)在多巴胺能神經(jīng)元中特異性、可調(diào)控

9、性的表達(dá)感興趣的基因。
   我們構(gòu)建了ES細(xì)胞基因打靶載體,順利的進(jìn)行了ES細(xì)胞同源打靶,通過(guò)Southern雜交鑒定出了陽(yáng)性的ES細(xì)胞克隆。并且我們對(duì)這些陽(yáng)性的克隆,用5'和3'端的探針重新進(jìn)行了Southern雜交鑒定。隨后我們準(zhǔn)備了ES細(xì)胞進(jìn)行顯微注射,已經(jīng)得到含有tTA和CHR2-mCherry基因的嵌合體小鼠,與C57BL/6雜交后,具有灰色皮膚的雜合子小鼠已經(jīng)長(zhǎng)大。這些雜合子小鼠將被用來(lái)進(jìn)行tTA和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)特異

10、性和表達(dá)豐度鑒定,并且我們還將利用doxycycline來(lái)調(diào)控這些轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
   總之,我們發(fā)現(xiàn)DJ-1mRNA在超過(guò)96%的神經(jīng)元里表達(dá),但不在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞里表達(dá),而且DJ-1在黑質(zhì)的所有多巴胺能神經(jīng)元里都有表達(dá)。DJ-1是通過(guò)神經(jīng)元軸突運(yùn)輸并被分泌到細(xì)胞外,這提示我們DJ-1在細(xì)胞外具有重要的保護(hù)神經(jīng)元功能。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于最終闡明DJ-1缺失導(dǎo)致帕金森病的發(fā)病機(jī)理具有重要意義。我們還構(gòu)建了一個(gè)在多巴胺能神經(jīng)元中特異性過(guò)表

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