PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)PD模型細(xì)胞的線粒體和在體多巴胺能神經(jīng)元的影響.pdf

1、帕金森病(PD)是以黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元變形死亡為病理特征的一種神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病年齡平均為60歲。臨床表現(xiàn)為肌強(qiáng)直、靜止性震顫、步態(tài)和姿勢(shì)不穩(wěn)等運(yùn)動(dòng)障礙，以及失眠、抑郁等非運(yùn)動(dòng)癥狀，會(huì)嚴(yán)重影響老年人的健康。引發(fā)該病的因素包括遺傳、環(huán)境、藥物等，由這些因素導(dǎo)致的線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)聚集、炎癥反應(yīng)等是主要機(jī)制，其中線粒體功能障礙可能是重要的機(jī)制之一。線粒體是細(xì)胞的能量供給中心，同時(shí)也是生成氧自由基(ROS)的主要場(chǎng)所，

2、上述因素都可能使線粒體的電子傳遞鏈功能異常而生成ROS增加。ROS對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，使DA能神經(jīng)元變形死亡而引發(fā)PD。有實(shí)驗(yàn)證明，自噬-溶酶體系統(tǒng)與PD的發(fā)病有關(guān)，尤其與線粒體自噬密切相關(guān)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α（PGC-1α）在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)高表達(dá)，并與線粒體的生物發(fā)生和細(xì)胞自噬/線粒體自噬密切相關(guān)，使其在骨骼肌細(xì)胞的重塑過(guò)程中起著重要作用。這提示，PGC-1α可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體的自噬和生物發(fā)生

3、而對(duì)細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用。那么，如果人為提高PGC-1α的表達(dá)，能否對(duì)MPP+損傷的DA能神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)？其對(duì)細(xì)胞自噬/線粒體自噬有否影響？對(duì)在體DA能神經(jīng)元的損傷有否保護(hù)作用？對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥反應(yīng)有否影響？這些都是非常值得探討的問(wèn)題。對(duì)這些問(wèn)題的解明將有助于確定PGC-1α能否作為防治PD的藥物靶點(diǎn)提供必要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，具有一定的理論和實(shí)際意義。
　　針對(duì)上述問(wèn)題，本研究擬以SH-SY5Y細(xì)胞和C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，用MP

4、P+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷復(fù)制PD細(xì)胞模型，通過(guò)腹腔注射MPTP復(fù)制C57BL/6小鼠的PD模型。首先采用MTT比色法、FJC染色法、Hoechst33342染色法來(lái)確定MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的最佳損傷條件;將細(xì)胞和動(dòng)物均分為CON組、MPP+(MPTP)組、NCOE+MPP+(MPTP)組和OE+MPP+(MPTP)組;在OE+MPP+(MPTP)組，用構(gòu)建好的PGC-1α過(guò)表達(dá)慢病毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞和小鼠中腦黑質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)

5、染使其過(guò)表達(dá);通過(guò)MTT比色法檢測(cè)以上四組SH-SY5Y細(xì)胞的存活率的變化，然后采用Real-time PCR來(lái)探究PGC-1α過(guò)表達(dá)后線粒體相關(guān)基因和自噬相關(guān)基因mRNA水平的變化;用免疫熒光染色法來(lái)觀察中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)變化，從而為上述問(wèn)題尋找答案。
　　實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如下:
　　1.當(dāng)MPP+的濃度為1 mmol/L，對(duì)細(xì)胞作用時(shí)間為24 h時(shí)，細(xì)胞存活率接近50％，所以MPP+的使

6、用濃度1 mmol/L作用24 h為MPP+損傷的最適建模條件。
　　2.通過(guò)FJC染色法、Hoechst33342染色法檢測(cè)MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的損傷發(fā)現(xiàn)，隨著與MPP+孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，說(shuō)明MPP+損傷與孵育時(shí)間成正相關(guān)，由以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮MPP+的損傷時(shí)間為24 h，濃度為1mmol/L。
　　3.利用PCR技術(shù)獲取目的基因后與線性載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR

7、鑒定，測(cè)序后與目的基因進(jìn)行比對(duì)得出重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果和目標(biāo)序列一致，獲得過(guò)表達(dá)載體。
　　4.ELISA法滴度檢測(cè)NCOE和OE病毒的滴度分別為1×109 TU/ml和2×108 TU/ml。
　　5.通過(guò)MTT比色法測(cè)定PGC-1α過(guò)表達(dá)后細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)PGC-1α過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞的存活率明顯上升。NCOE組較正常組無(wú)顯著性差異。OE組細(xì)胞的存活率較各組均有明顯升高的趨勢(shì)，且與MPP+組和NCOE組比具有極顯著的差異(P＜

8、0.01)，和CON組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　6.Real-time PCR檢測(cè)線粒體相關(guān)基因(NRF1、Drp1、Mfn2)、自噬相關(guān)基因(LC3B、p62)的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)PGC-1α過(guò)表達(dá)后，NRF1 mRNA的表達(dá)也顯著升高，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。而線粒體分裂、融合基因Drp1和Mfn2的mRNA表達(dá)也明顯升高。OE組Drp1較MPP+組具有極顯著差異(P＜0.01

9、)與NCOE組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Mfn2 mRNA的表達(dá)較MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。自噬相關(guān)基因LC3B的mRNA表達(dá)明顯降低，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。p62 mRNA的表達(dá)明顯升高，且與MPP+組和NCOE組比較均有極顯著差異(P＜0.01)。
　　7.對(duì)小鼠進(jìn)行黑質(zhì)立體定位注射PGC-1α過(guò)表達(dá)慢病毒基因干預(yù)后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，小鼠中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元

10、的數(shù)量沒(méi)有明顯的改善，TH陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。免疫熒光檢測(cè)PGC-1α的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)OE組PGC-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較MPTP組和NCOE組均有明顯增多的趨勢(shì)，且具有極顯著差異(P＜0.01)。尤其是在黑質(zhì)的致密部，PGC-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。雖然在細(xì)胞數(shù)上PGC-1α的表達(dá)是升高的，但是，由免疫熒光圖片我們可觀察到PGC-1α形態(tài)較為異常，細(xì)胞變得不規(guī)則。此外，免疫熒光統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示了，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了過(guò)

11、度激增的現(xiàn)象。
　　通過(guò)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，得出如下結(jié)論:
　　1.本研究檢測(cè)所得1 mmol/L的MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷24 h為MPP+的最適建模條件?？沙晒?fù)制出MPP+誘導(dǎo)的PD體外模型。
　　2.PD細(xì)胞模型中，過(guò)表達(dá)PGC-1α可以抵抗MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，抑制自噬的發(fā)生，增加MPP+損傷后NRF1的表達(dá)，提高線粒體融合基因Mfn2的表達(dá)對(duì)于改善線粒體功能，維護(hù)線粒體分裂融合的動(dòng)態(tài)平衡起到了一