乙醇對(duì)AC16心肌細(xì)胞線粒體生成的調(diào)節(jié)與PGC-1α表達(dá)的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　過(guò)量飲酒可導(dǎo)致酒精性心肌病(ACM)、冠心病等多種心血管疾病發(fā)病率及死亡率升高;也有大量研究表明，適量規(guī)律的飲酒可降低心血管疾病的發(fā)病率及死亡率，酒精的攝入量與心血管疾病的發(fā)生呈J型曲線關(guān)系。酒精性心肌病患者及多種酒精性心肌病動(dòng)物模型中均可發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)及功能異常。線粒體是細(xì)胞能量代謝的重要細(xì)胞器，其結(jié)構(gòu)及功能的改變對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)及功能的維持至關(guān)重要，由此我們推測(cè)乙醇對(duì)心肌組織的雙面作用可能與其對(duì)線粒體生成的

2、影響相關(guān)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisomeproliferator-activated receptor gamma co-activator，PGC-1α)是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵因子，它可作用于轉(zhuǎn)錄因子或其它輔激活因子，通過(guò)多種機(jī)制增加靶基因轉(zhuǎn)錄效率，對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激、適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體生成、葡萄糖代謝及脂肪酸β氧化等方面的調(diào)節(jié)具有重要作用，Lahman等人的研究指出PGC-1α是心肌細(xì)胞線粒體生成的關(guān)鍵

3、轉(zhuǎn)錄激活因子[33]，在維持心肌細(xì)胞能力供應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)意在研究不同濃度乙醇對(duì)AC16心肌細(xì)胞PGC-1α及其下游調(diào)控蛋白核呼吸因子-1(Nuclear respiratory factor-1，NRF-1)、轉(zhuǎn)錄因子A(Transcription Factor A，TFAM)表達(dá)水平的影響，探究酒精攝入與心血管疾病發(fā)病關(guān)系的分子學(xué)機(jī)制。
　　方法：
　　1、AC16心肌細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2、應(yīng)用MTT法檢測(cè)

4、不同乙醇濃度干預(yù)對(duì)AC16細(xì)胞存活率改變，選擇合適的乙醇濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3、電鏡下觀察不同乙醇濃度干預(yù)下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)JC-1熒光探針檢測(cè)不同乙醇濃度對(duì)線粒體膜電位影響。
　　5、應(yīng)用Real time PCR、Western-Blot技術(shù)分別在基因及蛋白水平檢測(cè)不同乙醇濃度對(duì)AC16細(xì)胞PGC-1α/NRF1/TFAM表達(dá)水平改變。
　　6、計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)

5、±s）表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1、應(yīng)用MTT法測(cè)定不同乙醇濃度對(duì)細(xì)胞生存率影響:200mmol/L以下乙醇濃度對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，當(dāng)濃度達(dá)到300mmol/L時(shí)細(xì)胞存活率下降至79.7±3.0％(n=3，P＜0.05)，500mmol/L時(shí)細(xì)胞存活率下降至48.9±2.0％(n=3，P＜0.05)。因此實(shí)驗(yàn)中設(shè)定200mmol/L為

6、最高乙醇濃度。實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組（0mmol/L），低濃度乙醇組(50mmol/L)，中濃度乙醇組(100mmol/L)，高濃度乙醇組(200mmol/L)。
　　2、電鏡下觀察不同濃度乙醇對(duì)AC16細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響:低濃度乙醇組(50mmol/L)，可見(jiàn)線粒體數(shù)量有所增加，線粒體結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常;高濃度乙醇組（200mmol/L）可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯減少，線粒體增大，線粒體內(nèi)脊結(jié)構(gòu)紊亂，時(shí)有線粒體脊結(jié)構(gòu)消失呈囊泡樣變。

7、r>　　3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同乙醇濃度對(duì)AC16細(xì)胞線粒體膜電位影響:低濃度乙醇組（50mmol/L）與正常對(duì)照組比較線粒體膜電位升高37.3±1.4％(n=3，P＜0.05);高濃度組乙醇(200mmol/L)與正常對(duì)照組比較線粒體膜電位下降31.9±2.1％(n=3,P＜0.05)。
　　4、Real-time PCR檢測(cè)不同濃度乙醇對(duì)AC16細(xì)胞PGC-1α/NRF1/TFAMmRNA表達(dá)水平影響:低濃度乙醇組(50mm

8、ol/L) AC16細(xì)胞PGC-1αmRNA表達(dá)增加84.2％±5.9％（n=3，P＜0.05）;高濃度乙醇組(200mmol/L) PGC-1αmRNA表達(dá)下降52.2±9.9％(n=3，P＜0.05)。PCG-1α的下游蛋白NRF-1、TFAM mRNA表達(dá)也有相同趨勢(shì)的改變。
　　5、Western-Blot檢測(cè)不同濃度乙醇對(duì)AC16細(xì)胞PGC-1α/NRF1/TFAM蛋白表達(dá)水平影響:不同乙醇濃度對(duì)PGC-1α蛋白表達(dá)影響

9、與mRNA表達(dá)趨勢(shì)改變一致，低濃度乙醇組PGC-1α蛋白表達(dá)上調(diào)49.4％±4.8％(n=3，P＜0.05);高濃度乙醇組PGC-1α蛋白下降47.2±2.7％(n=3，P＜0.05)。PGC-1α所調(diào)控的下游蛋白(NRF-1，TFAM)表達(dá)也有一致的表達(dá)趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　低濃度乙醇(50mmol/L)上調(diào)AC16心肌細(xì)胞PGC-1α及其下游蛋白NRF-1、TFAM表達(dá)，高濃度乙醇(200mmol/L)下調(diào)其表達(dá)，對(duì)細(xì)