缺氧早期心肌細(xì)胞微管損傷與線粒體損害的關(guān)系研究.pdf

1、缺氧是嚴(yán)重?zé)齻?chuàng)傷及其他多種疾病最常見的病理現(xiàn)象之一，缺氧導(dǎo)致的能量代謝障礙是引起細(xì)胞和組織器官損害的根本原因。然而，長期以來人們對缺氧條件下線粒體損害及能量代謝障礙的確切機(jī)制并不完全清楚，臨床上亦缺乏有效的調(diào)理措施。近年來研究表明，微管與線粒體之間存在密切的聯(lián)系，微管除了對線粒體胞內(nèi)定位及分布起一定作用外，更重要的是微管還可能了參與了線粒體呼吸功能的調(diào)節(jié)過程。這一觀點的證實將有助于為揭示缺氧細(xì)胞能量代謝障礙的發(fā)生機(jī)制與調(diào)控環(huán)節(jié)提供新

2、的切入點，為防治缺氧損害提供新的理論依據(jù)與思路，具有重要的理論意義與臨床指導(dǎo)價值。為證實這一推測，我們觀察了缺氧早期不同時相點的微管及線粒體變化情況，并利用特異性微管解聚劑研究了微管損傷情況下線粒體相關(guān)變化。 一、材料與方法 1．原代培養(yǎng)wistar大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，制備缺氧模型。 2．在缺氧后10、20、30、60min 4個不同時相點，利用掃描電鏡觀察微管的形態(tài)結(jié)構(gòu)；采用激光共聚焦顯微鏡觀察微管的分布，并計算

3、微管的熒光強(qiáng)度；應(yīng)用Western—Blot檢測微管蛋白α亞基的表達(dá)量改變，研究缺氧早期心肌細(xì)胞微管損害的時效對應(yīng)性。 3．在缺氧后10、20、30、60min 4個不同時相點，利用透射電鏡觀察線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)；采用激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體的分布，并計算線粒體的熒光強(qiáng)度；應(yīng)用生物耗氧呼吸儀檢測心肌細(xì)胞的呼吸控制率；應(yīng)用高效液相色譜儀檢測心肌細(xì)胞ATP含量，研究缺氧早期心肌細(xì)胞線粒體損害情況。 4．以秋水仙素解聚微管，建

4、立微管解聚模型。 5．在解聚微管并缺氧后10、20、30、60min 4個不同時相點，觀測缺氧心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)、分布、呼吸控制率和ATP含量，與缺氧組進(jìn)行比較，分析微管損害在線粒體損害中的作用。 6．統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗。以P<0.05和P<0.01分別表示相差顯著和非常顯著。 二、主要結(jié)果 1．缺氧后10min，心肌細(xì)胞微管的念珠狀

5、結(jié)構(gòu)即消失，微管蛋白熒光強(qiáng)度降低，微管蛋白α亞基表達(dá)量增加；缺氧20min后，微管結(jié)構(gòu)性破壞加重，至1h出現(xiàn)微管分布規(guī)律性喪失，微管蛋白熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低，微管蛋白α亞基表達(dá)量進(jìn)一步增加。 2．缺氧后10min，線粒體未見明顯形態(tài)改變。缺氧20min后，線粒體出現(xiàn)濃縮，不同程度腫脹，嵴模糊甚至溶解，空泡化，胞漿內(nèi)有聚集的糖原致密顆粒(提示儲積的糖原不能及時轉(zhuǎn)化為能量，線粒體功能受損)等明顯形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變，且隨缺氧時間延長而加重。

6、線粒體功能也出現(xiàn)相應(yīng)改變。缺氧10min，心肌細(xì)胞RCR較正常組顯著降低，但ATP含量變化不明顯；缺氧20 min、30min和1h，隨缺氧時間延長，各組RCR和ATP含量較正常組進(jìn)一步顯著下降。線粒體活性染色表明，缺氧1h內(nèi)線粒體的染色活性并未受到嚴(yán)重影響。提示缺氧情況下，微管損害略早于線粒體結(jié)構(gòu)與功能損害。 3．單純微管解聚即可使線粒體RCR和ATP顯著降低；缺氧20min、30min、1h后，缺氧解聚組線粒體分布規(guī)律性及形

7、態(tài)結(jié)構(gòu)損害均較單純較缺氧組加重；缺氧20min、30min、1h后，缺氧解聚組心肌細(xì)胞RCR、胞漿ATP含量顯著低于單純?nèi)毖踅M(P值均<0.01)。 三、結(jié)論 1．心肌細(xì)胞缺氧后10min即可出現(xiàn)微管解聚，提示微管損傷是缺氧心肌細(xì)胞損傷的早期事件，且隨缺氧時間的延長而加重。 2．缺氧20min后，線粒體先出現(xiàn)RCR和ATP下降等功能性損害，隨后出現(xiàn)明顯的分布和結(jié)構(gòu)損害，提示缺氧情況下，微管損害略早于線粒體結(jié)構(gòu)與功