MAP4對(duì)缺氧心肌細(xì)胞微管的穩(wěn)定作用及相關(guān)效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：觀察缺氧條件下體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞微管相關(guān)蛋白4(MAP4)的變化與微管變化的關(guān)系，以及上調(diào)MAP4表達(dá)對(duì)微管穩(wěn)定性、細(xì)胞活力、凋亡及能量代謝的影響。 方法：分別在常氧及缺氧(1％O2、5％CO2、94％N2)條件下培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，觀測(cè)不同缺氧時(shí)間心肌細(xì)胞α-tubulin和MAP4含量變化；克隆大鼠MAP4基因，構(gòu)建包含MAP4cDNA的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體并轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞；觀測(cè)轉(zhuǎn)染48h后心肌細(xì)胞在各缺氧時(shí)刻細(xì)胞

2、能量代謝(HPLC法)、細(xì)胞活力(MTT法)、細(xì)胞凋亡(TUNEL法)等生理生化指標(biāo)；應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞MAP4蛋白表達(dá)及對(duì)微管的作用。 結(jié)果：1、正常心肌細(xì)胞內(nèi)微管均勻分布，細(xì)胞形態(tài)完整，MAP4定位于由α、β-tubulin異二聚體形成的微管束之上。隨著缺氧時(shí)間的變化，心肌細(xì)胞內(nèi)MAP4和α-tubulin表達(dá)顯著減少；與此同時(shí)心肌細(xì)胞微管顯著破壞，可見(jiàn)大量斷裂微管分布于核周，心肌細(xì)胞微管MAP4免疫熒光染色強(qiáng)

3、度顯著降低。說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯聚合狀態(tài)微管存在，細(xì)胞骨架完整性嚴(yán)重受損。WesternBlot半定量檢測(cè)結(jié)果表明，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，α-tubulin蛋白和MAP4含量逐漸減少。 2、克隆了全長(zhǎng)為3174bp的大鼠心肌細(xì)胞MAP4cDNA片斷，并將其包裝入腺病毒基因組中成功構(gòu)建了復(fù)制缺陷型Ad-MAP4腺病毒載體。 3、上調(diào)MAP4表達(dá)有助于穩(wěn)定缺氧條件下的微管并維持其形態(tài)特征。 4、缺氧0.5h～3h，心肌細(xì)胞

4、ATP含量即急劇下降，ADP、AMP含量則急劇增高；6h～12hATP含量維持在一較低水平，而ADP、AMP增速減緩，總的變化趨勢(shì)與ATP相反。Ad-MAP4轉(zhuǎn)染組與單純?nèi)毖踅M相比，早期ATP含量下降速度較單純?nèi)毖踅M緩慢，于3h之后兩組間的變化趨于一致，能荷、ATP/ADP比值的變化趨勢(shì)與ATP相似，而ADP、AMP變化趨勢(shì)與ATP相反。 5、單純?nèi)毖踅M和Ad-EGFP對(duì)照組心肌細(xì)胞活力均顯著下降，而1h、3h和6h，Ad-MA

5、P4(MOI=30和MOI=45)轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞活力明顯高于單純?nèi)毖踅M。 6、缺氧可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，受缺氧刺激，單純?nèi)毖踅M和Ad-MAP4組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量均開(kāi)始增加，缺氧3h和12h進(jìn)一步增多，但Ad-MAP4組從缺氧3h開(kāi)始其細(xì)胞凋亡數(shù)略低于單純?nèi)毖踅M，缺氧12h，兩組間有顯著差別(P＜0.05)。 說(shuō)明缺氧早期(0～3h)MAP4表達(dá)上調(diào)并未對(duì)缺氧引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)在12h處，A

6、d-MAP4組細(xì)胞凋亡數(shù)才顯著低于單純?nèi)毖踅M。有關(guān)MAP4對(duì)缺氧心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用有待進(jìn)一步探討。 討論與結(jié)論：1、本研究發(fā)現(xiàn)，MAP4定位于由α、β-Tubulin蛋白形成的聚合態(tài)微管束，缺氧可使心肌細(xì)胞微管破壞，MAP4顯著降低。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，α-tubulin蛋白和MAP4在心肌細(xì)胞中的含量逐漸減少。 2.本研究成功構(gòu)建了包裝有大鼠MAP4基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了載體的有效性，并篩選

7、出適合大鼠心肌細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)為30～45。 3.上調(diào)MAP4表達(dá)有助于維持缺氧心肌細(xì)胞微管的穩(wěn)定，對(duì)缺氧早期心肌細(xì)胞能量代謝及生理活性的具有一定的維持作用。但不影響正常培養(yǎng)狀態(tài)下心肌細(xì)胞的活性和生理功能。 4.MAP4表達(dá)上調(diào)可明顯改善缺氧早期(0.5～3h)心肌細(xì)胞ATP和能荷水平，維持細(xì)胞活力。但隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞最終仍發(fā)生不可避免的能量代謝障礙和細(xì)胞的相對(duì)活力下降。 5.本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染M