機(jī)械牽張加重缺血缺氧心肌細(xì)胞損傷的效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、生物體本身處于外在的力學(xué)環(huán)境中,而生物體內(nèi)部也保持著一種靜態(tài)或動(dòng)態(tài)的力學(xué)相互作用.研究表明,外在物理力和內(nèi)部應(yīng)力對(duì)于細(xì)胞生長、形態(tài)維持和分化起到了重要的作用.其中細(xì)胞骨架介導(dǎo)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)是近年來的研究熱點(diǎn).然而,上述研究多集中于機(jī)械因素對(duì)正常細(xì)胞的作用及其機(jī)理研究,病理?xiàng)l件下,特別是缺血缺氧條件下機(jī)械刺激的細(xì)胞效應(yīng)及機(jī)制研究尚未見報(bào)道.正常情況下,心臟內(nèi)血流使心肌充盈,心腔擴(kuò)張,對(duì)心肌產(chǎn)生一定的牽張刺激.嚴(yán)重?zé)齻缙谟捎谌毖毖跖c炎癥反應(yīng)

2、失控即發(fā)生了器質(zhì)性心肌損害.此時(shí)血容量的減少以及過多過快補(bǔ)液所造成的血容量迅速增加等血液動(dòng)力學(xué)的急劇變化使心肌細(xì)胞所受到的牽張刺激發(fā)生變化.牽張刺激的變化對(duì)于業(yè)已存在的心肌損害有何影響尚不清楚.顯然,研究這種病理?xiàng)l件下心肌損害的發(fā)生機(jī)理更具有直接意義.臨床研究表明,燒傷補(bǔ)液后血液中心肌酶含量較補(bǔ)液前顯著上升,表明補(bǔ)液后心肌損害進(jìn)一步加重,其機(jī)制卻不甚明了.同時(shí),由于目前對(duì)于防治"休克心"缺乏有效的治療手段都促使我們進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)理并

3、尋找新的干預(yù)手段.由于細(xì)胞骨架在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、特別是機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用,我們推測其可能在"休克心"的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用.為了驗(yàn)證上述設(shè)想,我們設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn):一、研究目的:明確機(jī)械牽張加重缺血缺氧對(duì)離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的損傷效應(yīng),探討細(xì)胞骨架(微絲、微管)在其中的作用及機(jī)制.二、材料方法:1. 采用離體培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞,建立機(jī)械牽張模型,從細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)液中LDH含量及心肌細(xì)胞PI染色陽性率等幾個(gè)方面明確機(jī)械牽張對(duì)心肌細(xì)胞的影響.2

4、. 利用模型進(jìn)一步施加缺血缺氧因素,分別檢測10﹪牽張、缺血缺氧、10﹪牽張+缺血缺氧三組細(xì)胞在1、3、6、12h不同時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)(免疫熒光)、培養(yǎng)液LDH含量、TNF-αmRNA(RT-PCR)、MHCmRNA(RT-PCR)、PI染色陽性率的變化.3.分別檢測10﹪牽張、缺血缺氧、10﹪牽張+缺血缺氧三組細(xì)胞在不同時(shí)相點(diǎn)微管、微絲蛋白含量(Western Blotting)及形態(tài)的變化(激光共聚焦顯微鏡).4. 檢測細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑

5、taxol或(和)phalloidin對(duì)10﹪牽張+缺血缺氧組心肌細(xì)胞形態(tài)民、培養(yǎng)液LDH含量、TNF-αmRNA(RT-PCR)、MHCmRNA(RT-PCR)、PI染色陽性率的影響.三、主要結(jié)果:1. 通過比較、設(shè)計(jì)、調(diào)整,成功建立了心肌細(xì)胞體外牽張刺激模型.該模型具有制作方便、操作簡單、易于觀察的優(yōu)點(diǎn).大鼠心肌細(xì)胞在硅酮膜上生長狀態(tài)良好.培養(yǎng)液中LDH含量及心肌細(xì)胞PI染色與正常對(duì)照組無明顯差別.心肌細(xì)胞的進(jìn)一步鋪展及偽足的大量出

6、現(xiàn)..2. 與正常對(duì)照、10﹪牽張組和缺血缺氧組比較,10﹪牽張+缺血缺氧組心肌細(xì)胞有以下明顯不同:LDH升高異常明顯,呈現(xiàn)爆發(fā)性升高特點(diǎn),各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均顯著高于正常組 (P<0.01) ,且與其它各組比較均明顯增高 (P<0.01) ;TNF-αmRNA表達(dá)上升明顯,增幅高于缺血缺氧組;β-MHC mRNA于表達(dá)峰提前,3h即達(dá)高峰,其后迅速降低,12h時(shí)與缺血缺氧組相比有明顯下降;PI染色陽性心肌細(xì)胞比例明顯增加.3. 正常非肌節(jié)型微

7、絲在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)相互交錯(cuò)網(wǎng)絡(luò)狀分布,受到機(jī)械牽張后表現(xiàn)為蛋白含量增加及發(fā)生與受力方向相關(guān)的重排;缺血缺氧后出現(xiàn)破壞,隨時(shí)間延長破壞加劇;10﹪牽張+缺血缺氧刺激后細(xì)胞骨架破壞明顯加速,表現(xiàn)在蛋白含量急劇下降及形態(tài)破壞加劇.微管呈現(xiàn)類似變化趨勢,但其變化更加劇烈.4. 以微絲穩(wěn)定劑taxol或(和)微管穩(wěn)定劑phalloidin對(duì)10﹪牽張+缺血缺氧組心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后,各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量、PI染色陽性率明顯下降,MHCmRNAα型

8、相對(duì)表達(dá)量下降減慢及β型波動(dòng)減小.穩(wěn)定微管后TNF-αmRNA上升趨勢明顯減弱.四、討論:1. 設(shè)計(jì)了一種簡單、經(jīng)濟(jì)、易行的單軸靜態(tài)機(jī)械細(xì)胞牽張裝置,實(shí)現(xiàn)了對(duì)缺血缺氧這一病理生理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞的機(jī)械牽張.利用所建立的模型證實(shí)了10﹪的機(jī)械刺激強(qiáng)度在心肌細(xì)胞正常的生理范圍之內(nèi),對(duì)于細(xì)胞無急性損傷效應(yīng).10﹪牽張12h后細(xì)胞的進(jìn)一步鋪展、偽足增多進(jìn)一步提示了細(xì)胞功能活躍,結(jié)合其它文獻(xiàn)一致說明了適度的機(jī)械刺激是一種正性刺激.2. 通過與正常組

9、、10﹪牽張組和缺血缺氧組的比較,可以看出機(jī)械牽張+缺血缺氧組心肌細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重.表現(xiàn)在:形態(tài)破壞的加劇,加重缺血缺氧對(duì)心肌細(xì)胞膜的損傷,加劇缺血缺氧對(duì)心肌細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的上調(diào)以及加劇缺血缺氧對(duì)心肌細(xì)胞收縮蛋白基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié).這就提示機(jī)械牽張加重了缺血缺氧對(duì)心肌細(xì)胞的損傷效應(yīng).3. 10﹪牽張能夠顯著增強(qiáng)缺血缺氧對(duì)心肌細(xì)胞微管、微絲的破壞作用,表現(xiàn)在微絲的斷裂及蛋白含量的減少.可能與隨著缺血缺氧造成能量潰乏時(shí)間的延長,細(xì)胞骨架對(duì)

10、機(jī)械刺激的耐受減弱,造成此時(shí)機(jī)械牽張對(duì)骨架的破壞加劇有關(guān).同時(shí),這也進(jìn)一步證實(shí)了機(jī)械牽張加重缺血缺氧心肌細(xì)胞損傷的效應(yīng).4. 微絲穩(wěn)定劑taxol或(和)微管穩(wěn)定劑phalloidin對(duì)10﹪牽張+缺血缺氧組心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后,該組心肌細(xì)胞損傷程度明顯減輕,說明穩(wěn)定細(xì)胞骨架能夠有效的減弱10﹪牽張對(duì)缺血缺氧心肌細(xì)胞的損傷效應(yīng).上述效應(yīng)可能與較好的維持細(xì)胞形態(tài)、減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制NF-ΚB的活化等有關(guān).5.該模型較好的模擬了嚴(yán)重?zé)齻?/p>