MAP4上調(diào)Dynlt1減輕缺氧早期心肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換的作用及機(jī)制研究.pdf

1、燒傷早期出現(xiàn)的心肌細(xì)胞骨架損傷可能是燒傷后細(xì)胞能量代謝障礙的重要機(jī)制之一。本課題組以往的系列研究表明，細(xì)胞骨架的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能正常與否對胞內(nèi)線粒體功能和細(xì)胞能量代謝具有直接而重要的影響。因此，我們提出了從細(xì)胞骨架的調(diào)控入手，尋找微管與線粒體間的橋梁分子，減輕缺氧后線粒體通透性轉(zhuǎn)換，改善心肌細(xì)胞能量代謝的思路。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MAP4有助于維持缺氧心肌細(xì)胞微管的穩(wěn)定，明顯改善缺氧早期(Hypoxia＜3h)心肌細(xì)胞ATP和能荷水平，維持細(xì)

2、胞活力，改善和維持缺氧早期心肌細(xì)胞能量代謝及生理活性。
　　應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，我們篩選出與線粒體外膜MPTP主要成分VDAC(VDAC1)可能存在相互作用的新蛋白質(zhì)分子——動力蛋白輕鏈1，認(rèn)為Dynlt1可能是微管(MT)對線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)進(jìn)行調(diào)控作用的中間橋梁分子，其具體結(jié)構(gòu)方式為：MitoVDAC-Dynlt1/Dynein-MT。
　　本課題旨在研究Dynlt1通過穩(wěn)定VDAC，進(jìn)而減輕缺氧早期線粒體通

3、透性轉(zhuǎn)換，以證明“細(xì)胞骨架在缺氧心肌細(xì)胞能量代謝障礙中具有重要作用”的假設(shè)。
　　材料與方法:
　　1、以免疫組化雙標(biāo)記、co-IP等技術(shù)手段，觀察體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中Dynlt1及VDAC表達(dá)定位，并驗(yàn)證在哺乳動物細(xì)胞中Dynlt1-VDAC、Dynlt1-MT是否存在相互作用。進(jìn)一步觀察破壞微管結(jié)構(gòu)之后，Dynlt1的分布變化規(guī)律及與微管的關(guān)系。
　　2、用包含MAP4基因的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)

4、染HeLa細(xì)胞。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察過表達(dá)MAP4對細(xì)胞微管的穩(wěn)定作用，并觀察此過程中Dynlt1的表達(dá)變化，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞活力，四甲基羅丹明乙酯(TMRE)觀察線粒體膜電位(ΔΨ)，酯化鈣黃綠素(Calcein-AM)觀察MPTP開放程度。進(jìn)而明確過表達(dá)MAP4可以穩(wěn)定微管，同時Dynlt1含量增加可減輕缺氧早期線粒體通透性轉(zhuǎn)換。
　　3、以Dynlt1 shRNA Plasmid轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克

5、隆，構(gòu)建持續(xù)低表達(dá)Dynlt1的細(xì)胞株HeLa-dD。運(yùn)用MTT、TMRE、Calcein-AM等手段觀察低表達(dá)Dynlt1后，細(xì)胞相對活力、ΔΨ、MPTP開放程度，以及在此條件下過表達(dá)MAP4之后對細(xì)胞活力的影響。
　　主要結(jié)果與結(jié)論:
　　1.胞漿中Dynlt1與MT、Dynlt1與VDAC有著明顯的共區(qū)域分布特征，大量Dynlt1沿微管結(jié)構(gòu)區(qū)域伴行分布，常氧下VDAC幾乎都與Dynlt1有密切共定位。Dynlt1分子與

6、細(xì)胞中的微管結(jié)構(gòu)在空間分布上具有緊密關(guān)系，同時Co-IP證明Dynlt1與VDAC具有確切的蛋白質(zhì)相互作用，提示兩者在功能方面有密切的相互影響。
　　2.胞內(nèi)Dynlt1的分布因微管的破壞而變化，微管破壞的同時使Dynlt1分子從微管上脫落，并且隨著缺氧時間延長，Dynlt1分子脫落的程度加劇。說明微管與Dynlt1在結(jié)構(gòu)分布和其所發(fā)揮作用的時空上具有密切的關(guān)系。缺氧使線粒體受破壞，線粒體外膜的VDAC也因線粒體的破壞而含量減少。

7、提示Dynlt1與VDAC在胞漿中有廣泛結(jié)合。
　　3. MAP4過表達(dá)可以確切的維護(hù)缺氧早期細(xì)胞活力，并減輕缺氧所致的微管結(jié)構(gòu)破壞；可以維護(hù)細(xì)胞線粒體膜電位，減少線粒體通透性轉(zhuǎn)變；過表達(dá)MAP4可以上調(diào)Dynlt1的表達(dá)，且這一作用非常強(qiáng)烈。
　　4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dynlt1 shRNA慢病毒質(zhì)粒，形成了持續(xù)低表達(dá)Dynlt1的細(xì)胞株HeLa-dD。在此基礎(chǔ)上初步探討了“Dynlt1表達(dá)增強(qiáng)”與“MAP4改善缺氧細(xì)胞能量代謝障