DYNLT1絲氨酸82位點(diǎn)模擬磷酸化對缺氧細(xì)胞微管和mPTP的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、嚴(yán)重?zé)?創(chuàng))傷后早期即可導(dǎo)致心臟、胃腸道等組織臟器的缺血缺氧,其發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重影響傷情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。缺氧細(xì)胞早期即可發(fā)生能量代謝障礙,其中線粒體損傷是核心環(huán)節(jié)。微管在細(xì)胞中起著支架作用,同時(shí)與線粒體之間存在密切的功能聯(lián)系。缺氧可以導(dǎo)致微管解聚和線粒體膜通透性增加,影響細(xì)胞能量代謝并引發(fā)凋亡。動力蛋白作為微管和線粒體之間的橋梁分子,發(fā)揮著除貨物運(yùn)輸之外的其他作用。前期研究發(fā)現(xiàn),動力蛋白輕鏈1(DYNLT1)和線粒體電壓依賴性陰離子通道(VDA

2、C)之間存在共定位和蛋白相互作用,可能是新的線粒體膜通透性調(diào)控分子,其低表達(dá)可加重線粒體對于缺氧損害的敏感程度,但機(jī)制不明。根據(jù)前期研究和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,缺氧可激活p38/MAPK通路并磷酸化微管相關(guān)蛋白,而DYNLT1位點(diǎn)S82的磷酸化可影響動力蛋白形成及其貨物輸送能力。據(jù)此,我們推測:缺氧可能導(dǎo)致DYNLT1的磷酸化,并對微管和線粒體功能產(chǎn)生影響。
　　本課題旨在研究缺氧時(shí) DYNLT1的磷酸化變化對于微管和線粒體的影響,選取S

3、82位點(diǎn)采用位點(diǎn)突變手段模擬過磷酸化和去磷酸化,觀測其對于微管聚合/解聚平衡、線粒體通透性轉(zhuǎn)換、細(xì)胞能量代謝的影響,以進(jìn)一步探明缺氧病理損害的機(jī)制以及動力蛋白的結(jié)構(gòu)功能,以期為減輕細(xì)胞缺氧損害尋找新靶點(diǎn)。
　　一、材料與方法
　　1、首先驗(yàn)證缺氧環(huán)境下DYNLT1的磷酸化改變并建立S82位點(diǎn)突變的細(xì)胞模型。采用免疫共沉淀(IP)、Western blot法觀測缺氧時(shí)H9c2和HeLa細(xì)胞中DYNLT1的絲氨酸磷酸化程度;在此

4、基礎(chǔ)上構(gòu)建S82位點(diǎn)的磷酸化抗體(anti-phospho-S82),檢驗(yàn)不同缺氧程度導(dǎo)致的S82磷酸化變化;通過基因位點(diǎn)突變技術(shù)將S82分別突變?yōu)楣劝彼崮M過磷酸化狀態(tài)(S82E)、突變?yōu)楸彼崮M去磷酸化狀態(tài)(S82A),包裝重組腺病毒(Ad- S82E/ S82A)后分別轉(zhuǎn)染H9c2/HeLa細(xì)胞株使其穩(wěn)定表達(dá),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)建立模擬磷酸化的細(xì)胞模型。
　　2、采用Western blot法定量檢測和免疫熒光顯微技術(shù)的形態(tài)學(xué)觀察

5、,從兩方面檢驗(yàn)不同程度磷酸化調(diào)節(jié)的DYNLT1對于缺氧微管結(jié)構(gòu)的影響。首先檢測缺氧時(shí)胞質(zhì)內(nèi)聚合態(tài)(Ploymeric)與非聚合態(tài)(Monomeric)微管蛋白的含量變化;再利用Ad- S82E/ S82A腺病毒分別轉(zhuǎn)染H9c2/HeLa,對比不同磷酸化修飾的DYNLT1對于缺氧時(shí)微管解聚(tubulin定量和鏡下微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)觀測)的影響。
　　3、同法建立上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞缺氧模型后,熒光顯微鏡下對比觀察不同S82模擬磷酸化狀態(tài)對于線粒

6、體膜通透性mPT的影響。采用酯化鈣黃綠素(Calcein-AM)和氯化鈷(CoCl2)共孵育的方法檢測mPTP的開放情況;采用四甲基羅丹明乙酯(TMRE)熒光染色法檢測線粒體膜電位MMP的變化;Western blot法檢測各組Cyt c的漏出。
　　4、同法建立轉(zhuǎn)染后H9c2/HeLa細(xì)胞缺氧模型,檢測S82位點(diǎn)突變對于細(xì)胞能量代謝的影響: CCK-8法檢測細(xì)胞活力、各組胞漿ATP含量和生成率。
　　5、從常氧、缺氧正反兩

7、方面論證來探尋可能的S82位點(diǎn)磷酸化信號調(diào)節(jié)通路:p38/MAPK。首先驗(yàn)證缺氧可激活 p38/MAPK信號通路;采用 p38抑制劑 SB203580檢測缺氧時(shí)對pS82的抑制作用;通過MKK6重組腺病毒轉(zhuǎn)染從上游激活p38,檢測常氧時(shí)對pS82表達(dá)的上調(diào)作用。
　　二、主要結(jié)果與結(jié)論
　　1、缺氧可導(dǎo)致DYNLT1發(fā)生磷酸化改變。H9c2/HeLa細(xì)胞缺氧0.5h、1h、3h、6h時(shí),均發(fā)現(xiàn) DYNLT1發(fā)生了絲氨酸磷酸化

8、,呈早期增強(qiáng)、后期降低的趨勢,峰值最早出現(xiàn)在缺氧1h。S82位點(diǎn)的缺氧磷酸化變化與此相同。針對S82位點(diǎn)采用腺病毒轉(zhuǎn)染方法成功設(shè)計(jì)了S82E/S82A突變,分別模擬過磷酸化和去磷酸化狀態(tài)。
　　2、缺氧可破壞微管聚合/解聚平衡使之向解聚傾斜。S82E模擬過磷酸化可加重缺氧細(xì)胞的微管解聚,表現(xiàn)為游離微管蛋白增多,微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)排列松散、熒光強(qiáng)度降低;S82A模擬去磷酸化可減輕缺氧導(dǎo)致的微管結(jié)構(gòu)破壞,對于微管結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。
　

9、　3、缺氧可誘導(dǎo)mPTP開放增加,導(dǎo)致線粒體功能障礙。S82E模擬過磷酸化加重了缺氧后的MMP下降,使mPTP開放和Cyt c從線粒體內(nèi)漏出增加。 S82A對于缺氧后的mPTP開放有一定的遏制作用。
　　4、缺氧后線粒體功能障礙直接導(dǎo)致能量代謝障礙。不同磷酸化修飾對胞漿ATP含量未見明顯影響,但S82E可降低線粒體ATP合成率,而S82A對線粒體ATP合成率無明顯改善作用。
　　5、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧使p38/MAPK通路激活,抑