線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的分子機理研究.pdf

1、背景：再灌注損傷(Reperfusion injury，RI)是急性心肌梗塞與缺血性中風等眾多心血管疾病病理損害的主要機制。在缺血后再灌注的頭幾分鐘，細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，氧化自由基大量生成和無機磷離子濃度增加，促使線粒體內(nèi)膜上形成大量非特異性的通透轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial permeability transition pore，mPTP)，使線粒體內(nèi)膜喪失屏障作用，大量溶質(zhì)分子進入線粒體，導致線粒體氧化磷酸化脫偶聯(lián)、基質(zhì)腫

2、脹、膜電位下降和線粒體崩解，當受累的線粒體數(shù)量與程度達到一定閾值，便會發(fā)生細胞死亡。盡管有大量關于mPTP的研究，究竟mPTP的分子身份是什么，到目前為止還不清楚。當前研究發(fā)現(xiàn)同屬于線粒體溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體家族(Solute carriers，SLCs)的磷轉(zhuǎn)運體(Phosphate carrier，PiC)和腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運體(ADP/ATP translocase，ANT)可能參與了mPTP的形成。利用序列比對結(jié)合種系發(fā)生分析，發(fā)現(xiàn)線粒體溶

3、質(zhì)轉(zhuǎn)運體家族成員中存在序列及結(jié)構(gòu)相似較高成員谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運體(Aspartate/glutamatecarriers，AGC)和ATP-Mg/Pi轉(zhuǎn)運體(ATP-Mg/Pi carriers)，推測其可能參與了mPTP的形成和開放。
　　 目的：闡明mPTP的分子身份；揭示mPTP各成員在細胞死亡的作用。
　　 方法：利用RT-PCR技術(shù)檢測SLCs成員的表達亞型并作為研究對象，進一步通過RNAi干擾技術(shù)對初步篩選

4、的線粒體溶質(zhì)運載體家族的PiC、ANT、AGC與ATP-Mg/Pi轉(zhuǎn)運體進行了逐一和聯(lián)合干擾，用1.8mM/L鈣離子和5μMIonomycin刺激1小時后，Western-blotting檢測細胞色素c釋放。采用同樣的干擾和刺激方法檢測細胞死亡數(shù)目的變化，進一步用TMRM檢測線粒體膜電位的變化。
　　 結(jié)果：RNAi干擾H9c2細胞系和新生大鼠心肌細胞中的PiC、ANT2和ATP-Mg/Pi均能顯著降低高鈣誘導的細胞色素c的釋放

5、，而RNAi干擾ANT1和AGC后細胞色素c的釋放量同對照組相比沒有明顯變化。同樣，RNAi干擾H9c2細胞系和新生大鼠心肌細胞中的PiC、ANT2和ATP-Mg/Pi后，可以顯著降低高鈣誘導的細胞死亡，而且H9c2細胞系模擬缺血再灌注的實驗結(jié)果表明，干擾上述SLC25A家族成員，可使線粒體膜電位保持較高水平。
　　 結(jié)論：PiC、ANT2和ATP-Mg/Pi均參與了高鈣誘導的mPTP的形成和開放，RNAi干擾這些成員會降低細胞