頭部淺低溫對全腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體通透性轉換孔及細胞調亡的影響.pdf

1、目的:本實驗通過四血管阻斷法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，在此基礎上運用鼻咽腔降溫法對大鼠進行頭部淺低溫，并應用線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放劑蒼術苷在大鼠全腦缺血前進行側腦室注射，來觀察再灌注期間大鼠海馬MPTP的開放情況，海馬CA1區(qū)細胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)蛋白、 Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表達。研究頭部淺低溫對全腦

2、缺血再灌注損傷大鼠MPTP及細胞凋亡的影響，進一步探討淺低溫腦保護的作用機制，為以后臨床治療腦缺血再灌注損傷疾病提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、實驗分組
　　體重250～300g的健康雄性清結級SD大鼠72只（由河北醫(yī)科大學實驗動物中心供應）。將大鼠隨機分成6組(n=12):假手術組（S組）、全腦缺血/再灌注組(IR組)、低溫組（H組）、蒼術苷組（A組）、低溫+蒼術苷組(HA組)、低溫+生理鹽水組（HN組）。<

3、br>　　2、全腦缺血再灌注模型制備
　　制備大鼠全腦缺血再灌注模型應用的是改良的Pulsinelli四血管阻斷法。大鼠常規(guī)禁食8小時，無需禁水，稱重后10％水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉成功后俯臥固定于動物實驗臺，于頸后正中第一、二頸椎處剪毛消毒后切開皮膚，逐層分離，暴露雙側翼小孔。用自制電烙鐵燒灼兩側翼小孔內椎動脈使其永久閉塞，縫合皮膚。24 h后相同方法麻醉大鼠，仰臥固定于實驗臺上，氣管插管保留自主呼吸吸氧

4、，頸前正中剪毛消毒切開皮膚，分離雙側頸總動脈，穿線備用。此過程中，大鼠間斷吸入七氟醚維持麻醉，尾靜脈穿刺置管持續(xù)泵入乳酸鈉林格氏液維持循環(huán)。
　　3、實驗處理及監(jiān)測
　　大鼠全腦缺血時間為15min，再灌注24 h。不同組給予不同處理:
　　S組作為假手術組只暴露雙側翼小孔，不燒灼椎動脈;只分離頸總動脈，不對其夾閉。其它五組都燒灼椎動脈夾閉頸總動脈，制成全腦缺血再灌注模型。其中，H組、HA組和HN組進行低溫處理:在大鼠

5、氣管插管后，咽喉部氣管插管旁置入棉球和吸痰管（低溫過程中持續(xù)吸引）以防止誤吸，雙側鼻腔置入20G硅膠管，深度約為20 mm，持續(xù)泵入4-5℃的冷鹽水，速度為100 ml·min-1·kg-1，實施頭部淺低溫，等到海馬溫度降至（33.0±0.5）℃后，雙側頸總動脈閉塞15 min，低溫維持1h后保持自然復溫。HA組和A組于再灌注前10 min蒼術苷15 ul左側腦室緩慢注射。HN組左側腦室注射等量生理鹽水。術中監(jiān)測腦電圖（頭皮刺入電極）、

6、心電圖（四肢皮下刺入電極）、海馬溫度（溫度探頭置入右側海馬CA1區(qū)即前囟后3.6 mm、中線右旁開3 mm和皮層下2 mm）以及直腸溫度（維持在37.0±0.5℃）。
　　4、標本制備及檢測
　　4.1紫分光光度儀檢測海馬MPTP開放情況
　　再灌注24 h后，每組取6只大鼠進行麻醉（10％水合氯醛腹腔注射），然后迅速斷頭分離出海馬組織，根據(jù)線粒體提取試劑盒說明提取海馬線粒體，整個過程均在0～4℃下完成。提出的線粒體用

7、于MPTP開放情況的檢測。
　　4.2免疫組織化學法測定海馬CA1區(qū)Cyt C蛋白、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表達
　　每組取另外6只大鼠麻醉成功后，用4％多聚甲醛迅速經(jīng)心灌流固定，固定后快速斷頭取出腦組織并繼續(xù)固定于4％多聚甲醛中，然后放入4℃冰箱中保存，用于免疫組織化學檢測。
　　結果:
　　1、六組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2、大鼠海馬神經(jīng)元MPTP開放程度的比較
　

8、　與S組相比，其余各組MPTP吸光值減少程度均增大，MPTP開放程度增加(P＜0.05);與IR組比，H組、HA組和HN組MPTP吸光值減少程度降低，MPTP開放程度減小(P＜0.05);與H組比較，HA組MPTP吸光值減少程度增加，MPTP開放程度增加(P＜0.05)。
　　3、大鼠海馬CA1區(qū)Cyt C蛋白的比較
　　與S組相比，其余五組Cyt C蛋白表達均增多(P＜0.05);與IR組相比，H組、HN組和HA組Cyt

9、C蛋白表達均減少(P＜0.05);與H組相比，HA組Cyt C蛋白表達增多(P＜0.05)。H組和HN組、IR組和A組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　4、大鼠海馬CA1區(qū)Bax、 Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax的比較
　　與S組比較，其它五組Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達均增加，H組和HN組Bcl-2/Bax比值升高，IR組和A組Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.05);與IR組比較，H組和HN組Bc

10、l-2蛋白表達增加、Bax蛋白表達減少、Bcl-2/Bax比值升高(P＜0.05);與H組和HN組比較，HA組Bcl-2蛋白表達減少、Bax蛋白表達增多、Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.05)。H組和HN組比較、IR組和A組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結論:
　　1、頭部淺低溫可有效減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷，抑制細胞凋亡，有神經(jīng)保護作用。
　　2、頭部淺低溫的腦保護作用機制與抑制海馬細胞MPT