依達(dá)拉奉對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性及MMP-9表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察自由基清除劑依達(dá)拉奉對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障(BBB)通透性及腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表達(dá)的影響,探討自由基清除劑保護(hù)血腦屏障的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的制備
　　 雄性SD大鼠48只,體重200—250g(河北醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供),月齡2～3個(gè)月。隨機(jī)分為3組,假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(R組)、依達(dá)拉奉組(Y組),每組16只。

2、S組:暴露股動(dòng)靜脈,只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,經(jīng)枕骨大孔腹側(cè)開顱暴露基底動(dòng)脈第二無血管區(qū),穿線但不阻斷。R組:采用3血管阻斷法阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈、基底動(dòng)脈第二無血管區(qū)15 min后再開放。Y組:采用3血管阻斷法阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈,基底動(dòng)脈第二無血管區(qū)15 min后開放,同時(shí)尾靜脈給藥。依達(dá)拉奉組給予依達(dá)拉奉3mg/kg,濃度為1.5mg/ml。假手術(shù)組和R組給予生理鹽水2ml/kg,三組均再灌注12h。
　　 2標(biāo)本的采集及檢測方法

3、>　　 2.1各組動(dòng)物腦缺血前5 min(T1)、腦缺血15 man(T2)、再灌注后15 min(T3)分別采集股動(dòng)脈血監(jiān)測動(dòng)脈血氧分壓和二氧化碳分壓。
　　 2.2大鼠腦組織內(nèi)MMP-9的濃度的測定
　　 48只雄性SD大鼠于再灌注12h,每組隨機(jī)抽取8只首先水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,斷頭處死大鼠,完整取出腦組織,右側(cè)大腦除去額葉皮質(zhì)其余腦組織制成勻漿,以3500r/min轉(zhuǎn)速離心10min,取上清液液氮罐內(nèi)保存?zhèn)?/p>

4、用。按照大鼠腦組織勻漿MMP-9酶聯(lián)免疫試劑盒說明書要求測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程。根據(jù)回歸方程最后求得每個(gè)標(biāo)本的MMP-9濃度。
　　 2.3電鏡觀察皮質(zhì)的病理學(xué)改變
　　 取右側(cè)大腦額葉皮質(zhì)組織,按照“快、小、輕、準(zhǔn)”原則在冰盤上切取1mm×1mm×1mm的組織塊于4％戊二醛中固定,4℃冰箱中保存1h以上,送電鏡室在透射電鏡下觀察BBB的超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 2.4大鼠腦組織含水量

5、的測定
　　 完整取出腦組織后,去除中腦、腦橋、垂體等留取左側(cè)大腦組織,用濾紙吸干表面水分后置于干燥小瓶中,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ酶蓾裰胤?110℃,24h烘干)計(jì)算腦組織含水量作為腦水腫程度的判斷。計(jì)算方法:腦含水量(％)=(濕重一千重)/濕重×100％。
　　 2.5大鼠每克腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)含量的測定
　　 每組其余8只雄性SD大鼠于再灌注12h用10％水合氯醛再次麻醉大鼠,經(jīng)股靜脈注入2％EB生理鹽水溶液

6、(4 ml/kg)1h后開胸,通過左心室灌注室溫生理鹽水(灌注壓為110 mmHg),直到右心房流出的液體無色為止斷頭取腦。去除小腦及腦垂體留取雙側(cè)大腦組織剝離干凈軟腦膜、血凝塊,稱重,勻漿,放入其4倍體積甲酰胺的離心管中,加上橡皮塞50℃水浴48h,以3000r/min轉(zhuǎn)速離心15min,取上清液待測
　　 結(jié)果：
　　 1在腦缺血前5 min(T1)、腦缺血15 min(T2)、再灌注后15 min(T3)血?dú)庵笜?biāo)比

7、較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)
　　 2大鼠腦組織內(nèi)MMP-9濃度的測定
　　 S組腦組織內(nèi)MMP-9濃度為(3.98±0.45)％,R組為(7.33±2.46)％,Y組為(5.23±1.67)％。與S組相比,R組腦組織內(nèi)MMP-9濃度明顯增高(P<0.05)；與R組相比,Y組腦組織內(nèi)MMP-9濃度明顯降低(P>0.05)。
　　 3大鼠腦組織含水量的測定
　　 S組腦組織含水量為(75.16±1.7

8、8)％,R組為(81.38±1.67)％,H組為(76.55±1.54)％。與S組相比,R組腦組織含水量明顯增高(P<0.05)；與R組相比,Y組腦組織含水量明顯降低(P>0.05)。
　　 4大鼠每克腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)含量的測定
　　 S組腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)含量為(3.71±0.12)ug/g,R組為(5.00±0.25)ug/g,Y組為(3.93±0.14)ug/g。與S組相比,R組每克腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)含量明顯增高(P<

9、0.05)；與R組相比,Y組每克腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)含量明顯降低(P>0.05)。
　　 5透射電鏡下BBB的超微結(jié)構(gòu)改變
　　 S組:毛細(xì)血管外周小部分輕度水腫,腔面微絨毛數(shù)量減少,管腔內(nèi)未見血細(xì)胞。線粒體部分嵴和膜融合或消失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度脫顆粒,吞飲小泡數(shù)量稍微減少。R組:毛細(xì)血管周圍高度水腫(四面),腔內(nèi)一個(gè)紅細(xì)胞,微絨毛數(shù)量稍微減少。線粒體大部分嵴或部分膜融合或消失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象嚴(yán)重,吞飲小泡數(shù)量減少。Y組