烏司他丁對全腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性和Caveolin-1蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的:通過觀察烏司他丁對全腦缺血15min再灌注6h、24h、48h后大鼠血腦屏障通透性的變化及對小窩蛋白-1(Caveolin-1，CAV-1)、閉合小環(huán)蛋白-1(ZonulaOccludens-1，ZO-1)蛋白表達(dá)的改變，探討烏司他丁對全腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用。
　　方法:清潔級健康雄性Wistar大鼠108只，體重240g-280g，隨機(jī)分為3組(n=12):假手術(shù)組（Sham Group，S組）、全腦缺血再灌注

2、模型組(Global CerebralIschemia/Reperfusion Injury Model Group，GCI/R組)、10，000U/Kg烏司他丁干預(yù)組（Ulinastatin Intervention Group，U組）。采用Pulsinelli四血管法(4-vesseloccluding，4-VO)建立大鼠全腦缺血再灌注模型。在全腦缺血15min再灌注6h、24h、48h三個時間點(diǎn)，分別采用伊文思藍(lán)(Evans Bl

3、ue，EB)染色法觀測全腦缺血再灌注損傷后血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的完整性;核磁共振(Magnetic resonance imaging，MRI)方法觀測全腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的變化;應(yīng)用免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting，WB)觀測海馬區(qū)CAV-1和ZO-1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:1、本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制全腦缺血

4、再灌注大鼠模型:大鼠在夾閉雙側(cè)頸總動脈后60s內(nèi)出現(xiàn)意識喪失;雙側(cè)瞳孔散大、角膜反射消失;四肢上舉;翻正反射消失。
　　2、EB染色顯示全腦缺血再灌注后，大鼠血腦屏障完整性受到破環(huán):S組在全腦缺血再灌注6h、24h、48h時均未見明顯藍(lán)染區(qū)，測定腦組織內(nèi)EB含量少;GCI/R組再灌注6h、24h、48h時均可見明顯藍(lán)染區(qū)，測定腦組織內(nèi)EB含量發(fā)現(xiàn)，再灌注后6h時EB含量開始增多，再灌注24h時EB含量達(dá)高峰，然后開始下降，但與S組

5、相比有顯著性差異(P＜0.05);U組EB染色區(qū)域較GCI/R組小，測定腦組織內(nèi)EB含量發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注后6h、24h、48h時與GCI/R相比有顯著性降低(P＜0.05)，但仍高于S組。
　　3、MR顯示全腦缺血再灌注損傷后大鼠血腦屏障出現(xiàn)滲漏。S組在全腦缺血再灌注后6h、24h、48h三個時間點(diǎn)觀察到，海馬CA1區(qū)、側(cè)腦室、第三腦室及皮層區(qū)等區(qū)域在給予釓噴酸葡胺注射液(Gadopentetic Acid Dimeglumin

6、e SaltInjection，Gd-DTPA)前后信號變化差異不大;GCI/R組在全腦缺血再灌注后6h、24h、48h三個時間點(diǎn)觀察到，海馬CA1區(qū)、側(cè)腦室、第三腦室及皮層區(qū)等區(qū)域通過Gd-DTPA增強(qiáng)后，顯現(xiàn)顯著的強(qiáng)化信號，而且強(qiáng)化信號強(qiáng)度明顯高于S組，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05);U組在全腦缺血再灌注6h、24h、48h三個時間點(diǎn)經(jīng)Gd-DTPA增強(qiáng)后，顯現(xiàn)的強(qiáng)化信號均高于S組，但顯著低于GCI/R組，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P

7、＜0.05)。
　　4、在經(jīng)過全腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)CAV-1蛋白的表達(dá)出現(xiàn)變化。免疫組織化學(xué)顯示:在全腦缺血再灌注后6h、24h、48h海馬區(qū)均顯現(xiàn)S組CAV-1陽性細(xì)胞數(shù)目表達(dá)較多;GCI/R組CAV-1陽性細(xì)胞數(shù)目顯著下降，明顯低于S組水平，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05);U組在再灌注各時間點(diǎn)的CAV-1陽性細(xì)胞數(shù)目低于S組水平，但顯著高于GCI/R組，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。同樣經(jīng)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行海馬區(qū)C

8、AV-1蛋白的測定也顯示，全腦缺血再灌注后6h、24h、48h，GCI/R組大鼠海馬區(qū)內(nèi)CAV-1蛋白表達(dá)水平顯著低于S組和U組，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05);而U組的CAV-1蛋白表達(dá)水平低于S組。
　　5、在經(jīng)過全腦缺血再灌注損傷后ZO-1蛋白的表達(dá)出現(xiàn)變化。免疫組織化學(xué)顯示:在全腦缺血再灌注后6h、24h、48h海馬區(qū)均顯現(xiàn)S組ZO-1陽性細(xì)胞數(shù)目表達(dá)較多;而GCI/R組ZO-1陽性細(xì)胞數(shù)目顯著下降，明顯低于S組水平，

9、統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05);而U組在再灌注后6h、24h、48h時間點(diǎn)的ZO-1陽性細(xì)胞數(shù)目低于S組水平，但顯著高于S組，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。經(jīng)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行海馬區(qū)ZO-1蛋白的測定也顯示，全腦缺血再灌注后6h、24h、48h三時間點(diǎn)，GCI/R組大鼠海馬區(qū)內(nèi)ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著低于S組和U組，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05);而U組的ZO-1蛋白表達(dá)水平低于S組。
　　結(jié)論:1、全腦缺血再灌注損傷大