微管解聚對心肌細胞電生理特性的影響及微管定量分析方法研究.pdf

1、微管是心肌細胞的主要骨架成分，參與維持細胞形態(tài)等一系列重要生理活動?！靶菘诵摹崩碚撜J為，在嚴重燒傷引發(fā)的心功能損害中，缺氧導致的微管解聚至關重要。然而，微管解聚對作為心肌細胞活性與功能基礎的電生理方面的作用一直缺乏系統(tǒng)的研究和觀察。另外，高度動態(tài)平衡的微管系統(tǒng)的研究一直依賴于顯微成像技術，這種傳統(tǒng)的方法存在觀察者主觀偏差等致命缺陷。因此，探討可客觀量化微管形態(tài)變化的新方法將為缺氧引起的微管解聚帶來新的認識。
　　本研究以大鼠乳鼠心

2、肌細胞作為研究對象，利用固定濃度、固定時間的秋水仙堿處理模擬特定缺氧環(huán)境下微管解聚的效應。將上述微管解聚效應作為單一實驗因素來觀察大鼠乳鼠心肌細胞各項電生理指標變化，以分析單純微管解聚所引起的電生理特性改變及機制。同時，基于標記微管形態(tài)的H9C2心肌細胞熒光圖像，用灰度直方圖(GLH)特征參數(shù)比較量化了秋水仙堿和缺氧引起微管解聚后微管形態(tài)變化，以進一步明確兩者的對照關系。
　　一、材料與方法
　　1.體外SD大鼠乳鼠心肌細胞

3、分離培養(yǎng)，分為正常對照組和微管解聚組。觀察秋水仙堿處理后微管變化:免疫熒光染色標記α微管蛋白，激光共聚焦顯微鏡下觀察微管形態(tài)變化;蛋白免疫印跡(WB)實驗檢測游離/聚合態(tài)α微管蛋白的含量變化。
　　2.體外SD大鼠乳鼠心肌細胞分離培養(yǎng)，分為正常對照組和微管解聚組。觀察秋水仙堿處理后電生理特性及耗氧量變化:倒置顯微鏡下實時錄制自主搏動以計算其搏動頻率;全細胞膜片鉗技術記錄心肌細胞動作電位(AP)、延遲整流型鉀離子通道電流(IK)和L

4、型鈣離子通道電流(ICa-L);氧微電極系統(tǒng)測定培養(yǎng)液中溶解氧濃度，間接反應心肌細胞耗氧量。
　　3.H9C2心肌細胞培養(yǎng)，分為正常對照組、缺氧組和秋水仙堿組?；跓晒鈽擞浳⒐艿臄?shù)字圖像進行定量分析:α微管蛋白免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡獲取微管數(shù)字圖像，Matlab7.0等軟件進行單細胞分割、去噪、等比例分區(qū)等處理并提取GLH特征參數(shù)。
　　二、主要結果
　　1.正常對照組乳鼠心肌細胞微管呈現(xiàn)線性管狀形態(tài)，結構清晰

5、完整，以核周為中心放射狀分布。微管解聚組細胞微管卷曲，念珠樣改變，結構遭破壞而斷裂，呈彌漫性分布，熒光強度也降低。微管解聚組聚合態(tài)微管蛋白含量降低，游離態(tài)微管蛋白含量增高。
　　2.微管解聚后乳鼠心肌細胞較正常對照組自主搏動頻率明顯升高，耗氧量也相應增加。
　　3.微管解聚組乳鼠心肌細胞AP形態(tài)發(fā)生明顯變化，復極化平臺期不明顯，動作電位時程(APD)明顯縮短，靜息電位（RP）和動作電位振幅(AMP)未見明顯變化。
　　

6、4.微管解聚組乳鼠心肌細胞IK電流增強，其Ⅰ-Ⅴ曲線較正常對照組上移，激活后各測試電壓下(0-40mV) IK電流密度峰值均增加;然而，ICa-L電流未見變化，其Ⅰ-Ⅴ曲線與正常對照組基本重疊，激活后各測試電壓下(-30-50mV) ICa-L電流密度峰值無明顯改變。
　　5.與正常對照組相比，缺氧組和秋水仙堿組H9C2心肌細胞微管形態(tài)量化參數(shù)呈類似的變化趨勢;且兩組均是在與細胞膜連接的正端更明顯。
　　三、結論
　　

7、1.微管解聚后IK增強，ICa-L電流不變，使得AP復極化增快，進而縮短APD，增快心肌細胞自主搏動頻率，增加其耗氧量，這可能是造成或加重心肌缺氧損害的重要因素。
　　2.基于熒光圖像，以GLH特征參數(shù)（均值，方差，偏度，峰度，能量，熵）量化微管形態(tài)是切實可行的。該方法證實:缺氧及秋水仙堿處理后心肌細胞整體及區(qū)域內微管形態(tài)量化特征相類似，存在對照關系。微管熒光圖像形態(tài)學灰度分析法能更加準確地分析判斷缺氧心肌細胞微管的變化及其程度，