抗心肌細(xì)胞損傷天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)與研究.pdf

1、目的：建立過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型及建立棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型，篩選獲得抵抗氧化應(yīng)激或脂毒性損傷的天然產(chǎn)物或活性更好的衍生物，并探討其作用機(jī)制。
　　方法：1）設(shè)置H2O2濃度和時(shí)間梯度損傷H9c2心肌細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力以確定穩(wěn)定的損傷模型條件；2）H9c2心肌細(xì)胞分組進(jìn)行處理（正常組，僅含CGA-6組，H2O2模型組，H2O2+CGA-6濃度梯度組）后進(jìn)行處理。

2、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力值，按試劑盒說明書檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）釋放量和過氧化氫酶（CAT）活性，熒光探針檢測(cè)各組胞內(nèi)活性氧（CM-H2DCFDA）和鈣離子信號(hào)（Fluo-4），線粒體膜電位（JC-1），Hoechst33342評(píng)價(jià)各組凋亡細(xì)胞核，Western Blot檢測(cè)線粒體凋亡通路和MAPK信號(hào)通路等相關(guān)蛋白水平的變化。3）設(shè)置PA濃度和時(shí)間梯度損傷H9c2心肌細(xì)胞，MTT法檢測(cè)化合物的細(xì)胞活力值以獲得穩(wěn)定的損傷模型條件；4）在P

3、A誘導(dǎo)心肌損傷模型上MTT法測(cè)定姜黃素衍生物的細(xì)胞活力值，Hoechst33342染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞核比率和Western Blot檢測(cè)cleaved caspase-3，p-JNK，p-NFκB表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1）H2O2濃度為0.3 mM孵育3 h獲得細(xì)胞活力值較為穩(wěn)定，作為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷模型篩選條件，篩選得到了包括CGA-6在內(nèi)的活性化合物14個(gè)；2）H9c2細(xì)胞經(jīng)CGA-6預(yù)孵育1 h和0.3 mM

4、H2O2共作用3 h后，結(jié)果顯示H2O2處理后的H9c2細(xì)胞，出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激，細(xì)胞活力值明顯下降，LDH釋放量增多，CAT活性降低，胞內(nèi)ROS和Ca2+上升，MMP下降，凋亡細(xì)胞比率增高，預(yù)孵育不同濃度的CGA-6可不同程度地改善上述情況，表明CGA-6可減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷。同時(shí)，Western blot結(jié)果表明CGA-6降低 H2O2引起的H9c2細(xì)胞凋亡是通過抑制線粒體依賴的凋亡途徑和MAPKs通路中ERK和

5、JNK的激活；3）PA濃度為0.4 mM作用20 h作為PA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷模型篩選條件；4）共得到17個(gè)抗PA誘導(dǎo)的心肌損傷的姜黃素衍生物，活性強(qiáng)于姜黃素；其中C16，C20，C37，C40具有良好的抗PA引起的細(xì)胞凋亡作用，C20和C40抵抗PA誘導(dǎo)的心肌凋亡可能與炎癥信號(hào)通路相關(guān)。
　　結(jié)論：1）綠原酸類似物CGA-6抵抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷作用優(yōu)于綠原酸，其可能的機(jī)制是經(jīng)其抗氧化應(yīng)激參與的線粒體凋亡通路