心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)心肌細(xì)胞的影響及通絡(luò)干預(yù)研究.pdf

1、“營(yíng)衛(wèi)理論”為中醫(yī)脈絡(luò)學(xué)說(shuō)的核心理論，營(yíng)行脈中，衛(wèi)行脈外，營(yíng)衛(wèi)之氣在脈絡(luò)的末端—孫絡(luò)發(fā)生交會(huì)生化，與西醫(yī)學(xué)微循環(huán)末端發(fā)生的物質(zhì)交換與能量代謝過(guò)程相吻合，其中微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持上述生理功能發(fā)揮著重要作用，對(duì)于揭示疾病的微血管發(fā)病機(jī)制具有重要價(jià)值。本研究以脈絡(luò)學(xué)說(shuō)營(yíng)衛(wèi)“由絡(luò)以通，交會(huì)生化”理論為指導(dǎo)，基于營(yíng)氣與血管內(nèi)皮、衛(wèi)氣與血管外膜及全身性神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)（NEI）相關(guān)性，建立同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型

2、，觀察其條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用；探討通心絡(luò)通過(guò)保護(hù)受損的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞減輕心肌細(xì)胞損傷的可能機(jī)制，為營(yíng)衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會(huì)生化”理論提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，也為從“孫絡(luò)—微血管”完整性保護(hù)角度治療血管病變開(kāi)辟新途徑。
　　第一部分同型半胱氨酸誘導(dǎo)損傷的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞的影響
　　目的：探討受損的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液能否引起心肌細(xì)胞的損傷。
　　方法：植塊法原代提取大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RCME

3、Cs）并采用免疫熒光法鑒定，10 mmol/L的Hcy干預(yù)RCMECs24 h建立心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組。CCK-8法檢測(cè)兩組 RCMECs生存活性；可見(jiàn)分光光度法、硝酸還原酶法和酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測(cè)兩組RCMECs上清液LDH、NO及ET-1含量。分別收取正常的RCMECs條件培養(yǎng)液（N-CM）和同型半胱氨酸誘導(dǎo)損傷的 RCMECs條件培養(yǎng)液（H-CM）。將 H9c2心肌細(xì)胞分為正常對(duì)照組（Normal）、N

4、-CM組和H-CM組。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化；CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞生存活性；酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液cTnT含量。
　　結(jié)果：
　　1大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及鑒定結(jié)果
　　植塊法分離的RCMECs培養(yǎng)至24 h時(shí)，可見(jiàn)組織塊周圍有未融合的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，其形態(tài)呈星型、梭形或多角形，吸棄組織塊、換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，細(xì)胞匯合成鋪路石樣。CD31免疫熒光鑒定結(jié)果顯示所提取的RCMEC

5、s純度大于95％。
　　2兩組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞生存活性比較
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞生存活性降低（P<0.01）。
　　3兩組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液LDH含量比較
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞上清液LDH含量升高（P<0.01）。
　　4兩組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液NO和ET-1含量比較
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞上清液NO含量降低（P<0.01），

6、ET-1含量升高（P<0.01）。
　　5各組H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)變化
　　Normal組細(xì)胞呈短梭形或不規(guī)則三角形，邊緣清楚，細(xì)胞核呈卵圓形居中；與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞邊緣模糊，體積縮小，呈團(tuán)簇狀，有較多細(xì)胞脫落，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，損傷嚴(yán)重。
　　6各組H9c2心肌細(xì)胞生存活性比較
　　與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞生存活性無(wú)明顯變

7、化（P>0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞生存活性降低（P<0.01）。
　　7各組H9c2心肌細(xì)胞上清液cTnT含量比較
　　與 Normal組比較， N-CM組細(xì)胞上清液 cTnT含量無(wú)明顯變化（ P>0.05）；與 N-CM組比較， H-CM組細(xì)胞上清液 cTnT含量升高（P<0.01）。
　　小結(jié)：
　　同型半胱氨酸可誘導(dǎo)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞具有損傷作用。
　

8、　第二部分通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)損傷的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用
　　目的：探討通心絡(luò)對(duì)受損心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法：
　　RCMECs分為5組：正常對(duì)照組（Normal）、同型半胱氨酸組（Hcy）、通心絡(luò)低濃度組（TXL-L）、通心絡(luò)中濃度組（TXL-M）、通心絡(luò)高濃度組（TXL-H）。CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞生存活性；羥胺法檢測(cè)細(xì)胞上清液中SOD的活性；TBA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中MDA的含量

9、；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6和ICAM-1的含量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS水平及凋亡率；RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞eNOS和NF-κB蛋白表達(dá)。
　　RCMECs分為7組：正常對(duì)照組（Normal）、Hcy干預(yù)5 h組（Hcy5 h）、Hcy干預(yù)5 h+TXL組（Hcy5 h+TXL）、Hcy干預(yù)10 h組（Hcy10 h）、Hcy干預(yù)10 h+TXL組（Hcy10 h+T

10、XL）、Hcy干預(yù)20 h組（Hcy20 h）、Hcy干預(yù)20 h+TXL組（Hcy20 h+TXL）。采用高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)。
　　RCMECs分為5組：正常對(duì)照組（Normal）、Hcy組、Hcy+TXL組、Hcy+LY294002組（LY294002為PI3K抑制劑）及Hcy+LY294002+TXL組。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；RT-PCR及Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞GRP78、CHO

11、P及caspase-12 mRNA及蛋白表達(dá)，Western Blot法檢測(cè)p-PI3K、t-PI3K、p-Akt及t-Akt蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞生存活性比較
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞生存活性降低（P<0.01）；與Hcy組比較，TXL-H組細(xì)胞生存活性升高（P<0.01）。
　　2各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)比較
　　與Normal組比較，H

12、cy組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01）；與Hcy組比較，TXL-L組、TXL-M組及TXL-H組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01）；與TXL-L組比較，TXL-M組及TXL-H組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01）；與TXL-M組比較，TXL-H組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　3各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)比較
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞ET-1 mRNA表

13、達(dá)上調(diào)（P<0.01）；與Hcy組比較，TXL-L組、TXL-M組及TXL-H組細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.01）。
　　4各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液SOD活性和MDA含量比較
　　與 Normal組比較，Hcy組細(xì)胞上清液 SOD活性降低（P<0.01）， MDA含量升高（P<0.01）；與Hcy組比較，TXL-L組、TXL-M組及TXL-H組細(xì)胞上清液SOD活性升高（P<0.01），TXL-M組及TXL

14、-H組細(xì)胞上清液MDA含量降低（P<0.01）；與TXL-L組比較，TXL-H組細(xì)胞上清液 SOD活性升高（P<0.05），TXL-M組及 TXL-H組細(xì)胞上清液 MDA含量降低（P<0.01）；與TXL-M組比較，TXL-H組細(xì)胞上清液MDA含量降低（P<0.01）。
　　5各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平比較
　　與 Normal組比較，Hcy組細(xì)胞 ROS水平升高（P<0.05）；與 Hcy組比較，TXL-H組細(xì)胞

15、ROS水平降低（P<0.05）。
　　6各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液IL-6和ICAM-1含量比較
　　與 Normal組比較，Hcy組細(xì)胞上清液 IL-6和 ICAM-1含量升高（P<0.01）；與Hcy組比較，TXL-M組及TXL-H組細(xì)胞上清液IL-6和ICAM-1含量降低（P<0.01）；與TXL-M組比較，TXL-H組細(xì)胞上清液IL-6和ICAM-1含量降低（P<0.05）。
　　7各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮

16、細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)比較
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01）；與Hcy組比較，TXL-L組、TXL-M組及TXL-H組細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01）；與TXL-L組比較，TXL-M組及TXL-H組細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01）；與TXL-M組比較，TXL-H組細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。
　　8各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)比較

17、
　　與 Normol組比較，Hcy5 h組細(xì)胞 GRP78蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05），Hcy10 h組及Hcy20 h組細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01）；與Hcy10 h組比較，Hcy10 h+TXL組細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01）；與Hcy20 h組比較，Hcy20 h+TXL組細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01）。
　　9各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞 p-PI3K、t-PI3K、p-A

18、kt和 t-Akt蛋白表達(dá)比較
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05， P<0.01），t-PI3K和t-Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）；與Hcy組比較，Hcy+TXL組細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05，P<0.01），t-PI3K和t-Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）；與Hcy+TXL組比較， Hcy+LY294002組及Hcy+LY29

19、4002+TXL組細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01），t-PI3K和t-Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）。
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.01）；與Hcy組比較，Hcy+TXL組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.01），Hcy+LY294002+TXL組細(xì)胞凋亡率降低（ P<0.01）， Hcy+LY294002組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化（P>0.05）；與Hcy+TXL組比較，Hcy+

20、LY294002+TXL組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.01）。
　　10各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率比較
　　11各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA及蛋白表達(dá)比較
　　與Normal組比較，Hcy組細(xì)胞GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)（ P<0.01）；與 Hcy組比較， Hcy+TXL組和Hcy+LY294002+TXL組細(xì)胞GRP78、C

21、HOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01），Hcy+LY294002組細(xì)胞GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（ P>0.05）；與 Hcy+TXL組比較， Hcy+LY294002+TXL組細(xì)胞GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01）。
　　小結(jié)：
　　通心絡(luò)可明顯改善受損心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存活性及分泌功能，與其抑制

22、細(xì)胞的氧化和炎癥損傷有關(guān)；通心絡(luò)還可通過(guò)改善 PI3K/Akt通路的活性抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　第三部分通心絡(luò)干預(yù)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用
　　目的：明確通心絡(luò)通過(guò)改善心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能對(duì)心肌細(xì)胞的間接保護(hù)作用。
　　方法：將 H9c2心肌細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組（Normal）、正常RCMECs條件培養(yǎng)液組（N-CM）、Hcy誘導(dǎo)損傷的RCMECs條件培養(yǎng)

23、液組（H-CM）和通心絡(luò)干預(yù)的 RCMECs條件培養(yǎng)液組（T-CM）。CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞生存活性；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞上清液cTnT含量；JC-1試劑檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS水平；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞Cyt C、CRT、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞CRT蛋白表達(dá)；活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察各組細(xì)胞的凋亡變化。
　　1各組H9c2心肌細(xì)胞生存活性比較

24、r>　　與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞生存活性無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞生存活性降低（P＜0.01）；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞生存活性升高（P＜0.01）。
　　2各組H9c2心肌細(xì)胞上清液cTnT含量比較
　　與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞上清液cTnT含量無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞上清液cTnT含量升高（P＜0.01）；與H-CM組比

25、較，T-CM組細(xì)胞上清液cTnT含量降低（P＜0.01）。
　　3各組H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位（MMP）比較
　　與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞MMP無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞MMP降低（P＜0.01）；與H-CM組比較， T-CM組細(xì)胞MMP升高（P＜0.01）。
　　4各組H9c2心肌細(xì)胞ROS水平比較
　　與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞ROS水平無(wú)明顯差異（

26、P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞ROS水平升高（P＜0.01）；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞ROS水平降低（P＜0.05）。
　　5各組H9c2心肌細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白（CRT）蛋白表達(dá)比較
　　與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞CRT蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，均較弱；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞CRT蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞CRT蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞皺縮明顯減輕。

27、　　6各組H9c2細(xì)胞CRT及細(xì)胞色素 C（Cyt C）蛋白表達(dá)比較
　　與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞CRT及Cyt C蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞CRT及Cyt C蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞CRT及Cyt C蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。
　　7活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡變化
　　活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)

28、態(tài)觀察15 h，發(fā)現(xiàn)Normal組細(xì)胞存活狀態(tài)良好，細(xì)胞核圓潤(rùn)無(wú)皺縮，邊緣清晰，熒光強(qiáng)度均一，部分細(xì)胞出現(xiàn)分裂增殖現(xiàn)象，極少數(shù)細(xì)胞凋亡（藍(lán)色為細(xì)胞核）；與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞狀態(tài)無(wú)明顯差異，部分細(xì)胞分裂增殖，極少數(shù)細(xì)胞凋亡；與 N-CM組比較，H-CM組細(xì)胞5 h內(nèi)有極少數(shù)細(xì)胞分裂增殖，5 h開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，5 h至15 h過(guò)程中部分細(xì)胞核皺縮、濃染，細(xì)胞核體積變小，核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞凋亡明顯，連續(xù)觀察至15 h

29、細(xì)胞數(shù)量也明顯減少；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞5 h未出現(xiàn)明顯的凋亡，有少數(shù)細(xì)胞分裂增殖，細(xì)胞狀態(tài)良好，5 h至15 h過(guò)程中有部分細(xì)胞核皺縮、碎裂，出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞凋亡，但凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　8各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較
　　與Normal組比較，N-CM組細(xì)胞Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與N-CM組比

30、較，H-CM組細(xì)胞Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；與H-CM組比較，T-CM組細(xì)胞Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05， P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。
　　小結(jié)：
　　通心絡(luò)干預(yù)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液能夠提高受損心肌細(xì)胞的生存活性、改善線粒體功能、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1

31、本研究以脈絡(luò)學(xué)說(shuō)營(yíng)衛(wèi)“由絡(luò)以通，交會(huì)生化”理論為指導(dǎo)，基于營(yíng)氣與血管內(nèi)皮、衛(wèi)氣與血管外膜及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)（NEI）相關(guān)性，以及“孫絡(luò)—微血管”解剖形態(tài)學(xué)同一性，探討同型半胱氨酸誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)心肌細(xì)胞的作用及通絡(luò)藥物干預(yù)機(jī)制，為營(yíng)衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會(huì)生化”理論提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，也為從“孫絡(luò)—微血管”完整性保護(hù)角度治療血管病變開(kāi)辟新途徑。
　　2同型半胱氨酸誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的條件培養(yǎng)液可降低心肌細(xì)胞生存

32、活性、抑制線粒體功能、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，提示心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能障礙可介導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，這與脈絡(luò)末端“孫絡(luò)—微血管”營(yíng)衛(wèi)交會(huì)生化功能異常所引起的臟腑組織病理?yè)p傷的過(guò)程相吻合。
　　3通心絡(luò)能夠減少心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化和炎癥損傷、抑制細(xì)胞凋亡，從而改善心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能。通心絡(luò)對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的調(diào)節(jié)作用可進(jìn)一步提高受損心肌細(xì)胞的生存活性、改善線粒體功能、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞，顯示通絡(luò)藥物可