NRG-1在缺血-再灌注冠脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞-心肌細(xì)胞之間的作用及其機(jī)制.pdf

1、背景及目的：
　　再灌注治療是缺血性心臟病發(fā)生急性血管堵塞時(shí)治療的關(guān)鍵，然而，再灌注常常并發(fā)缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/RI），可加重心肌損傷，導(dǎo)致病情惡化。I/RI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。內(nèi)皮細(xì)胞-心肌細(xì)胞的相互作用在調(diào)節(jié)心臟功能中占有重要地位，但其相互作用的機(jī)制仍不明確。研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞可以促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，減少缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。前期研究證實(shí)，I/RI

2、的發(fā)生與冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）和心肌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，我們前期研究顯示，胰島素通過抑制CMECs和心肌細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)缺血/再灌注心臟。但在此過程中，這兩種細(xì)胞之間的相互作用有待進(jìn)一步研究。
　　神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）是一種表皮生長(zhǎng)因子，可以保護(hù)心臟并促進(jìn)心臟發(fā)育成熟，主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放。但在I

3、/RI過程中，CMECs是否能釋放N RG-1，釋放的NRG-1是否能促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，尚未見報(bào)道。研究報(bào)道，NRG-1可作用于ErbB2受體激活ERK使其發(fā)生磷酸化，同時(shí)，ERK1/2可調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)，對(duì)I/RI的心肌起保護(hù)作用。然而，在CMECs-心肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，ERK是否在NRG-1保護(hù)缺血/再灌注心肌中起重要作用，以及ERK與COX-2是否有關(guān)聯(lián)仍不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立CMECs-心肌細(xì)胞相互作用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并模擬缺

4、血/再灌注損傷（simulated ischemia reperfusion，SI/R），觀察I/RI是否刺激CMECs釋放NRG-1，NRG-1是否可以保護(hù)缺血/再灌注心肌，并初步探討其發(fā)生機(jī)制。
　　方法：
　　1.分離培養(yǎng)大鼠冠脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞，建立模擬缺血/再灌注模型和CMECs-心肌細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀８鶕?jù)研究對(duì)象的不同，CMECs隨機(jī)分為對(duì)照組，SI/R組和SI/R+Ins（10-7mol/L）組，并分

5、別收集各組的培養(yǎng)上清。而心肌細(xì)胞隨機(jī)分為以下7組：對(duì)照組，SI/R組，SI/R+Coculture（共培養(yǎng)）組，SI/R+Coculture+anti-ErbB2（ErbB2抑制劑）組，SI/R+NRG-1組，SI/R+NRG-1+anti-ErbB2組，SI/R+NRG-1+PD（ERK1/2抑制劑PD98059）組。
　　2.心肌細(xì)胞的活性和凋亡指數(shù)分別用 MTT法和TUNEL法檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)，Western blot法檢測(cè)CM

6、ECs培養(yǎng)上清中NRG-1表達(dá)、心肌細(xì)胞ErbB2、ERK和COX-2蛋白或磷酸化水平，Caspase-3酶活性反應(yīng)心肌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離培養(yǎng)CMECs和心肌細(xì)胞，并建立了SI/R模型和CMECs-心肌細(xì)胞共培養(yǎng)模型。
　　2.SI/R（4h/4h）組的心肌細(xì)胞活性比對(duì)照組明顯降低（P<0.01），而SI/R+Coculture組細(xì)胞活性較SI/R組升高（P=0.02）。CMECs進(jìn)行SI/R（4

7、h/4h）處理后，誘導(dǎo)NRG-1的釋放（2.96±0.30），當(dāng)給予胰島素時(shí)，NRG-1升高更顯著（4.62±0.26）（均為P<0.01）。檢測(cè)SI/R不同時(shí)間的NRG-1分泌量，4h/4h時(shí)分泌量較對(duì)照組增加最顯著（P<0.01）。心肌細(xì)胞SI/R組凋亡指數(shù)和Casp ase-3酶活性比對(duì)照組明顯升高（27.97±0.90比3.58±0.23，P<0.01；375.93±11.76比100.00±0.00，P<0.01）。共培養(yǎng)或N

8、RG-1處理細(xì)胞后，凋亡指數(shù)和Caspase-3酶活性較SI/R組降低（16.82±1.03比27.97±0.90，P<0.01；166.16±15.15比375.93±11.76，P<0.01），且ErbB2和ERK磷酸化水平以及COX-2表達(dá)明顯增加（均為P<0.01）。用ErbB2或ERK1/2抑制劑預(yù)處理心肌細(xì)胞后，共培養(yǎng)和NRG-1的作用消失（均為P<0.01）。
　　結(jié)論：I/RI時(shí)CMECs可以釋放NRG-1，誘導(dǎo)心