膠質(zhì)瘤細胞與人腦微血管內(nèi)皮細胞之間ERK的作用機制.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)膠質(zhì)瘤是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中為最常見的，也是最難治愈的惡性腫瘤，起源于神經(jīng)外胚層的中樞神經(jīng)惡性原發(fā)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的35.26％-60.96%，占成人所有惡性腫瘤的2%，是一種嚴重危害著人體健康的常見惡性疾病。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，具有浸潤性生長、侵襲性強、易復(fù)發(fā)、血管豐富等生物學(xué)特征，而一般認為，正是膠質(zhì)瘤的這種高侵襲性、富血管化等以及它與血管內(nèi)皮細胞之間的一些相互作用而導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤難根治、愈后差、易復(fù)發(fā)等。

2、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的相互作用能夠促進膠質(zhì)瘤的侵襲性生長，但是具體機制尚不十分明確。因此，研究人腦微血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞之間的相互作用具有很重要的現(xiàn)實意義。神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為人類顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其本質(zhì)上是一種多基因參與，并且多基因異常的疾病。多數(shù)研究結(jié)果顯示，ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制、發(fā)展過程及其生物學(xué)行為有著密切的關(guān)系。在本實驗中，我們擬通

3、過觀察血管內(nèi)皮細胞分泌因子EGF對膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響，以及ERK信號通路相關(guān)因子反過來對血管內(nèi)皮細胞的影響來探討二者之間的相互作用及相關(guān)機制。
　　方法：
　　探討血管內(nèi)皮細胞分泌因子EGF對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)行為的影響。體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U87MG、U251，以及微血管內(nèi)皮細胞HBMEC，建立神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞二者之間的共培養(yǎng)體系；應(yīng)用ERK信號通路激動劑EGF和抑制劑PD9

4、8059處理人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87MG和U251，觀察ERK的活性改變時對細胞增殖、侵襲及擬血管形態(tài)的影響。按實驗要求將細胞分組，分別為神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞單獨培養(yǎng)組，二者共培養(yǎng)組，加入外源性EGF組和加入PD98059組。分別采取CCK-8法檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力，Transwell侵襲法檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力，擬血管形態(tài)實驗檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的擬血管形態(tài)形成的能力，Western Blots法檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞P-ERK的活化

5、。
　　探討神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞分泌的VEGF對血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)行為的影響以及EGF的分泌量的影響。按實驗的不同要求將細胞分組，分別為HBMEC單獨培養(yǎng)組，HBMEC與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)組。ELISA法檢測不同情況下血管內(nèi)皮細胞EGF的分泌量，血管生成實驗檢測不同情況下HBMEC血管生成的情況。
　　結(jié)果：
　?、俳Y(jié)果顯示，與對照組相比，與HBMEC共培養(yǎng)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力明顯增強。加入50ng/mL的外源性EG

6、F時，增殖能力明顯增強。而加入5μM/L PD98059時，增殖能力明顯降低。（p<0.05）
　　②與對照組相比（侵襲數(shù)目為105.33±6.110），與HBMEC共培養(yǎng)組U87MG的侵襲能力明顯增強（侵襲數(shù)目為261.67±10.214），U87MG加入50ng/mL EGF組細胞襲能力明顯增強（侵襲數(shù)目為214.33±11.150）。而U87MG加入5μM/L PD98059細胞侵襲能力明顯降低（侵襲數(shù)目為55.67±6.0

7、28）。U251細胞也表現(xiàn)出相似的結(jié)果，對照組、共培養(yǎng)組、加入EGF組、加入PD98059組細胞侵襲的數(shù)目分別為77.33±6.658、237.00±10.440、191.33±3.215、50.67±4.509。（p<0.05）
　?、叟c對照組相比(管腔直徑：130.112土2.022μm)，HBMEC共培養(yǎng)組U87MG相互融合，連接成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，擬血管形態(tài)形成的能力明顯增強(管腔直徑202.134土2.007μm)，U87MG

8、加入50ng/mL EGF組（223.19土2.012μm）擬血管形態(tài)形成的能力也明顯增強，而加入5UM/L PD98059組（76.199土2.833μm）細胞生長較為紊亂，擬血管形態(tài)管腔明顯變小。U251細胞也顯示出相似的結(jié)果，對照組、共培養(yǎng)組、加入EGF組、加入PD98059組細胞侵襲的數(shù)目分別為：90.122土2.733μm、230.112土2.662μm、143.2262.098μm、44.039土1.092μm。（p<0.0

9、5）
　?、芤訥APDH為內(nèi)參，結(jié)果顯示，與HBMEC共培養(yǎng)組P-ERK的表達明顯增強。加入50ng/mLEGF組P-ERK的表達也相對增強。而加入5μM/L PD98059組P-ERK的表達明顯降低。（p<0.05）
　　⑤結(jié)果顯示，HBMEC加入不同濃度的VEGF165時，EGF的分泌量不斷的增加。HBMEC與兩種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)時，EGF分泌量明顯增加。（p<0.05）
　?、藿Y(jié)果顯示，與對照組相比（管腔直徑

10、：115.12土1.731μm），HBMEC與U87MG共培養(yǎng)時，血管生成的能力明顯增加，細胞之間相互融合，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并且小管的數(shù)目及管腔直徑明顯增加（管腔直徑：245.228土1.993μm）。U251細胞也表現(xiàn)出相似的結(jié)果，管腔直徑：225.163土1.622μm。(p<0.05)
　　結(jié)論：
　　1.血管內(nèi)皮細胞分泌因子EGF能夠通過RAF-MAPK-ERK信號通路增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力，侵襲能力，擬血管形態(tài)