β-淀粉樣蛋白上調(diào)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞CCR5表達(dá)的機(jī)制及意義.pdf

1、目的： 在老年人中，阿爾茨海默氏病(AD)是癡呆發(fā)生最為常見的原因，在美國人的死因中占第四位。它的臨床特征包括進(jìn)行性的癡呆，漸進(jìn)的認(rèn)知能力下降。它主要的神經(jīng)病理特征包括老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)元和突起的丟失。老年斑和腦血管內(nèi)沉積的主要成份是β—淀粉樣蛋白(Aβ)，它由39—43個氨基酸殘基組成，是淀粉樣蛋白的前體蛋白經(jīng)過剪切形成。Aβ的聚集被認(rèn)為極可能是AD早期的必要因素。 腦血管功能失調(diào)促進(jìn)AD認(rèn)知能力下降和癡呆的發(fā)

2、生。血腦屏障主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成，是腦和循環(huán)系統(tǒng)之間的一個代謝和生理性屏障結(jié)構(gòu)，血腦屏障的功能在于阻止循環(huán)中的藥物、毒素等外源物質(zhì)入腦以保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受損害。體外分離培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMECs)就成為研究血腦屏障功能的理想對象。 近年的越來越多的證據(jù)表明，炎癥機(jī)制在AD發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。趨化因子屬于細(xì)胞因子家族，主要功能是募集單核細(xì)胞到炎癥部位。趨化因子受體5(CCR5)是一

3、種趨化因子的受體，免疫組織化學(xué)研究表明，AD病人Aβ的沉積伴隨活化的膠質(zhì)細(xì)胞中CCR5表達(dá)增加，這提示CCR5在調(diào)節(jié)AD病人的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。在我研究室以前的研究中，發(fā)現(xiàn)Aβ能夠上調(diào)HBMECS表面的CCR5蛋白表達(dá)，但其機(jī)制和意義并不清楚，本研究試圖回答該問題。 血腦屏障(BBB)通過內(nèi)皮細(xì)胞上的晚期糖基化末端產(chǎn)物受體(RAGE)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白—1(LRP—1)運輸Aβ。RAGE是細(xì)胞表面分子免疫球蛋白超家族的

4、一員，能夠與Aβ相互作用，是與AD發(fā)病相關(guān)的一個重要蛋白。在構(gòu)成血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞上，Aβ與RAGE相互作用引起循環(huán)中的Aβ通過跨細(xì)胞作用進(jìn)入腦內(nèi)。在AD病人的腦內(nèi)，RAGE的表達(dá)增加，使得進(jìn)入腦內(nèi)的Aβ增加并且在腦內(nèi)聚集，這與AD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。近年證實RAGE存在幾種亞型，它們編碼缺少了跨膜和胞漿段的截短的RAGE，這些分泌型的RAGE能夠與RAGE的配體結(jié)合，抑制RAGE的配體和受體相互作用，進(jìn)而抑制配體/受體軸的信號傳遞，這為我

5、們尋找預(yù)防和治療AD的有效方法提供一些新的思路。 那么Aβ是通過什么信號通路上調(diào)HBMECs上的CCR5表達(dá)？CCR5表達(dá)上調(diào)有什么重要的生物學(xué)意義呢？運輸循環(huán)系統(tǒng)中Aβ進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的RAGE是否參與了CCR5表達(dá)上調(diào)的過程呢？這些問題與AD病人的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，解決上述問題可望為我們尋找預(yù)防和治療AD病人的醫(yī)療方案積累一定的理論基礎(chǔ)。因此，本文主要針對解決上述問題展開相關(guān)的實驗。 方法： 一、研

6、究Aβ上調(diào)HBMECs上CCR5表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制 (一)細(xì)胞培養(yǎng) HBMECS培養(yǎng)于含10％胎牛血清和10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。 (二)熒光實時定量PCR法 檢測不同濃度和不同時間的Aβ對HBMECs上CCR5 mRNA表達(dá)的影響。 (三)Western—blot方法 檢測不同濃度和不同時間的Aβ對HBMECs上CCR5蛋白表達(dá)的影響。 (四)Western—

7、blot方法 檢測Aβ對MAPK/PI3K信號通路的影響。 (五)Western—blot方法 檢測Aβ對HBMECs上Egr—1表達(dá)的影響。 (六)染色質(zhì)免疫沉淀法 檢測轉(zhuǎn)錄因子Egr—1與CCR5啟動子的結(jié)合情況。 (七)建立Egr—1干擾的HBMECs細(xì)胞株 Egr—1 siRNAs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBMECs的細(xì)胞株，并用western—blot方法鑒定及檢測CCR5的表達(dá)情況。

8、 二、探討RAGE受體在Aβ上調(diào)HBMECs表面CCR5表達(dá)過程中的作用 (一)應(yīng)用RT-PCR方法分析不同濃度和不同時間Aβ對HBMECs上RAGE mRNA表達(dá)的影響。 (二)應(yīng)用Western—blot方法分析不同濃度和不同時間Aβ對HBMECs上RAGE蛋白表達(dá)的影響。 (三)應(yīng)用Western—blot方法檢測RAGE中和抗體對Aβ通過MAPK/PI3K信號分子上調(diào)CCR5表達(dá)的影響。

9、(四)真核表達(dá)載體構(gòu)建，脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBMECs，建立過表達(dá)RAGE的HBMECs細(xì)胞株(即HBMECRAGE+)。 1、重組質(zhì)粒pUCmT—RAGE的構(gòu)建。 2、真核表達(dá)載體構(gòu)建。 3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBMECs細(xì)胞株。 (五)真核表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞方法建立RAGE胞內(nèi)段缺失的HBMECs細(xì)胞株(即HBMECC-Truncated RAGE)和RAGE胞外段缺失的HBMECs細(xì)胞株(即HBMECN-

10、Truncated RAGE)。 方法同上 (六)應(yīng)用Western—blot方法檢測Aβ對HBMECRAGE+、HBMECC-Truncated RAGE和HBMECN-Truncated RAGE上CCR5的蛋白表達(dá)的影響，同時檢測后兩種轉(zhuǎn)染了截短型RAGE細(xì)胞中MAPK和AKT信號分子的表達(dá)情況。 三、研究Aβ上調(diào)CCR5表達(dá)對T淋巴細(xì)胞入腦的影響 (一)使用試劑盒分離AD病人外周血T淋巴細(xì)胞。

11、 (二)跨內(nèi)皮遷移實驗分析AD病人外周血T淋巴細(xì)胞、6T—CEM細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞穿過正常HBMEC單層及各種轉(zhuǎn)染的HBMEC單層的情況。 1、Aβ上調(diào)CCR5表達(dá)與T淋巴細(xì)胞穿過HBMEC單層相關(guān)。 (1)不同濃度的Aβ對6T—CEM細(xì)胞、AD病人外周血T淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞穿過HBMECS單層的影響。 (2)6T—CEM細(xì)胞、AD病人外周血T淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞穿過CCR5缺失突變的HBM

12、ECs(即HBMECCCR5—)和CCR5過表達(dá)的HBMECs(即HBMECCCR5+)單層的情況。 (3) Aβ對6T—CEM細(xì)胞和AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過CCR5缺失突變的HBMECs(即HBMECCCR5—)的影響。 2、RAGE受體參與T淋巴細(xì)胞穿過HBMEC單層的過程。 (1)RAGE中和抗體對6T—CEM細(xì)胞和AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過HBMEC單層的影響。 (2) Aβ對6T—CEM細(xì)

13、胞和AD病人外周血T淋巴細(xì)胞和JURKT細(xì)胞穿過過表達(dá)RAGE的HBMECs(即HBMECRAGE+)單層的影響。 (3) Aβ對6T—CEM細(xì)胞和AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過RAGE胞內(nèi)段缺失的HBMECs(即HBMECC-Truncated RAGE)單層和RAGE胞外段缺失的HBMECs(即HBMECN-Truncated RAGE)單層的影響 3、MPAK信號分子參與T淋巴細(xì)胞穿過HBMEC單層的過程。

14、(1)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將JNKsiRNAs和ERKsiRNAs分別瞬時轉(zhuǎn)染HBMECs，用Western—blot法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中JNK和ERK的表達(dá)情況，以及加入Aβ后CCR5的表達(dá)情況。 (2)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將JNKsiRNAs和ERKsiRNAs瞬時轉(zhuǎn)染到Transwell上室接種的HBMEC單層內(nèi)。 (3)檢測6T—CEM細(xì)胞和AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過JNK和ERK干擾后的HBMEC單層的情況。 4

15、、PI3K/AKT信號分子參與T淋巴細(xì)胞穿過HBMEC單層的過程。 (1) Western—blot方法：檢測PBK缺失突變的HBMECs(即PI3K/△P110)上CCR5的表達(dá)情況。 (2) Aβ對6T—CEM細(xì)胞和AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過PI3K/△P110的HBMEC單層的影響。 5、Egr—1參與T淋巴細(xì)胞穿過HBMEC單層的過程。 Aβ對6T—CEM細(xì)胞和AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過Eg