CCR5促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向動脈內(nèi)皮損傷部位遷移及其機(jī)制探討.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 趨化因子CCR5促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向動脈內(nèi)皮損傷部位遷移的研究
　　目的：
　　探討趨化因子CCR5在內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮損傷部位遷移的趨化作用。
　　方法：
　　1.動物模型
　　10-12周齡的2型糖尿病ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于實驗。選取8-10周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠用于內(nèi)皮祖細(xì)胞提取。
　　2.脾切除手術(shù)
　

2、　8-10周齡的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予0.8％戊巴比妥鈉(10 mg/kg)麻醉，沿小鼠左側(cè)腹部行10-15mm切口，脾臟周圍的動靜脈被結(jié)扎后移除脾臟，小鼠術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)7-14天，再行后續(xù)實驗。
　　3.小鼠2型糖尿病模型的建立
　　將脾切除的ApoE-/-C57BL/6J小鼠，按小鼠每公斤體重給予35mg鏈脲佐菌素(STZ，35mg/kg)，腹腔注射STZ溶液，間隔24h后再次腹腔注射給藥，連續(xù)注射3

3、天。對照組，ApoE-/-C57BL/6J小鼠腹腔給予等量的檸檬酸鈉緩沖液。造模后每天檢測小鼠體重變化，每周測量小鼠血糖，當(dāng)血糖值在300 mg/dl及其以上者，作為2型糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)。
　　4.小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　選取8-10周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下，分離提取小鼠脛骨，股骨和髂骨中的單個核細(xì)胞，梯度離心后接種在纖維連結(jié)蛋白包被的六孔板中，放置于37℃，5％ C

4、O2孵箱中培養(yǎng)，三天后細(xì)胞第一次給予完全換液，棄掉未貼壁的細(xì)胞。第六天時，細(xì)胞給予半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)至第七天即用于鑒定。細(xì)胞分別給予DiI-acLDL，BS-1 lectin和DAPI染色后，熒光顯微鏡觀察陽性染色細(xì)胞，三色熒光陽性染色的細(xì)胞即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　5.慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞
　　將過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的慢病毒載體按MOI=40轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中，攜帶有空白質(zhì)粒的慢病毒載體轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中作為陰性對照，轉(zhuǎn)染24小

5、時后給予完全換液，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。在內(nèi)皮祖細(xì)胞移植之前，培養(yǎng)的細(xì)胞給予CM-DiI(4 mg/ml)活細(xì)胞染料孵育15分鐘，雙重標(biāo)記的EPCs被收集，用于下一步試驗。
　　6.試驗設(shè)計
　　40只脾切除的2型糖尿病ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)24周，然后根據(jù)小鼠耳標(biāo)號，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表，將老鼠隨機(jī)分為三組:Control組:尾靜脈給予200μl無菌的P

6、BS，Lenti-EGFP組:尾靜脈給予200μl1×106攜帶有空載質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞，Lenti-CCR5組:尾靜脈給予200μl1×106攜帶有過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　7.免疫熒光檢測
　　CD31免疫熒光染色檢測小鼠主動脈根處內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分布。
　　8.內(nèi)皮祖細(xì)胞功能學(xué)檢測
　　Transwell遷移小室和Edu增殖能力實驗分別檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和增殖能力。
　　9.統(tǒng)計學(xué)分析

7、　　所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計分析采用t檢驗、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P＜0.05被認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建重組過表達(dá)慢病毒載體
　　經(jīng)重組慢病毒載體測序?qū)嶒烌炞C，CCR5慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建和包裝成功，空白載體的慢病毒滴度為3×1010 ifu/ml，CCR5過表達(dá)載體的慢病

8、毒滴度為2.8×1010 ifu/ml。
　　2.成功分離提取和鑒定EPCs
　　EPCs培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞分別給予DiI-acLDL（紅色），BS-1 lectin（綠色）和DAPI（藍(lán)色）染色后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90％以上細(xì)胞均能成功攝取DiI-acLDL和BS-1 lectin，表現(xiàn)為三色熒光（紅色+綠色+藍(lán)色）陽性。
　　3.慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs后感染效率
　　免疫熒光評價EPCs轉(zhuǎn)染慢病毒后的感染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8

9、0％及以上的細(xì)胞為綠色熒光蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞，提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功。
　　4.過表達(dá)CCR5增加EPCs向內(nèi)皮損傷部位的歸巢，動員
　　5.過表達(dá)CCR5增加EPCs遷移能力
　　為了檢測CCR5對EPCs功能學(xué)影響，我們分別檢測了Lenti-EGFP和Lenti-CCR5兩組細(xì)胞的增殖和遷移能力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在趨化因子CCL5存在的情況下，Lenti-CCR5組能明顯增加EPCs遷移能力(P＜0.01)，但是兩組細(xì)胞

10、的增殖能力并未見明顯差異（P=0.98）。
　　結(jié)論：
　　1.過表達(dá)CCR5能夠增加內(nèi)皮祖細(xì)胞向動脈內(nèi)皮損傷部位的歸巢、動員作用;
　　2.過表達(dá)CCR5能提高內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力，但是對其增殖能力沒有影響。
　　第二部分 過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5改善動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性
　　目的：
　　探討過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性研究。
　　方法:
　　1.動物模型
　　

11、10-12周齡的ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于實驗。選取8-10周齡的野生型C57BL/6J雄性小鼠用于內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取。
　　2.脾切除手術(shù)
　　8-10周齡的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予0.8％戊巴比妥鈉(10 mg/kg)麻醉，沿小鼠左側(cè)腹部行10-15mm切口，脾臟周圍的動靜脈被結(jié)扎后移除脾臟，小鼠術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)7-14天，再行后續(xù)實驗。
　　3.小鼠骨髓來源的EPCs分離、培養(yǎng)

12、及鑒定
　　選取8-10周齡的野生型C57BL/6J雄性小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下，分離提取小鼠脛骨，股骨和髂骨中的單個核細(xì)胞，梯度離心后接種在纖維連結(jié)蛋白包被的六孔板中，放置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，三天后細(xì)胞第一次給予完全換液，棄掉未貼壁的細(xì)胞。第六天時，細(xì)胞給予半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)至第七天即用于鑒定。
　　4.慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞
　　將過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的慢病毒載體按MOI=40轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中，攜帶有

13、空白質(zhì)粒的慢病毒載體轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中作為陰性對照，轉(zhuǎn)染24小時后給予完全換液，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。
　　5.試驗設(shè)計
　　60只脾切除的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)24周，然后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表，將老鼠隨機(jī)分為三組:Control組:尾靜脈給予200μl無菌的PBS，Lenti-EGFP組:尾靜脈給予200μl1×106攜帶有空載質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞，Lent

14、i-CCR5組:尾靜脈給予200μl1×106攜帶有過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞輸注后，所有老鼠改為普通飲食，繼續(xù)喂養(yǎng)6周后處死。
　　6.組織病理、免疫組化及免疫熒光檢測
　　油紅O染色實驗評價小鼠主動脈根處動脈粥樣斑塊面積，免疫組織化學(xué)染色方法分別檢測人和小鼠冠狀動脈處CCL5和CCR5的表達(dá)、小鼠主動脈根處平滑肌α肌動蛋白、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，、炎癥因子IL-6、MMP9等表達(dá)。免疫熒光染色方法檢測

15、小鼠主動脈根處內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。
　　7.免疫化學(xué)檢測
　　小鼠給予內(nèi)皮祖細(xì)胞移植后分別于0周和6周采集全血，高速離心后，收集血清。應(yīng)用小鼠動脈粥樣硬化相關(guān)的蛋白芯片檢測動脈粥樣硬化相關(guān)的22個炎癥指標(biāo)變化，Cluster version3.0和Java Tree View version1.60軟件用于分析蛋白芯片的結(jié)果。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

16、表示，計數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計分析采用t檢驗、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P＜0.05被認(rèn)為差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.CCL5和CCR5在人和ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊中的表達(dá)和分布情況
　　2.過表達(dá)CCR5增加EPCs向內(nèi)皮損傷部位的歸巢，動員
　　3.過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性影響
　　4.過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5降

17、低高脂血癥水平
　　5.過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對內(nèi)皮功能的影響
　　6.過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5降低炎癥因子表達(dá)
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0軟件分析。計量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計分析采用t檢驗、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P＜0.05被認(rèn)為差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.趨化因子CCL