黃連素調(diào)動內(nèi)皮祖細胞修復動脈內(nèi)皮細胞損傷的研究.pdf

1、本研究擬從動物試驗、細胞試驗和人體試驗，探討B(tài)R調(diào)動EPCs修復動脈內(nèi)皮細胞損傷的效果和作用機制。 1、大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細胞拉脫模型的建立。　　方法：12只雄性清潔級SD大鼠，脾臟切除兩周后，用隨機數(shù)字法將12只SD大鼠隨機等分為兩組：手術(shù)組(n=6)和假手術(shù)組(n=6)。頸部正中切口暴露左側(cè)頸總動脈及其分叉處，從分叉處向近心端游離頸總動脈約2 cm。從左頸外動脈向頸總動脈插入2F的Fogarty導管約1.5 cm，然后向?qū)?/p>

2、管內(nèi)注入200μl空氣，重復拉脫3次。最后結(jié)扎頸外動脈的游離端并縫合頸中部切口。假手術(shù)組只暴露左側(cè)頸總動脈及其分叉處，從分叉處向近心端游離頸總動脈約2cm。手術(shù)14 d后取損傷動脈段和對側(cè)的正常動脈。利用病理學、免疫組織化學和電鏡技術(shù)等方法評價，拉脫模型建立的效果。 結(jié)論:利用2F的Fogarty球囊導管可以建立大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細胞拉脫模型。 2、大鼠內(nèi)皮祖細胞的體外誘導培養(yǎng)和鑒定方法：　　方法：從大鼠下腔靜脈取外周

3、血共30ml，利用Ficoll-paque離心法得到外周血單個核細胞。利用VEGF、bFGF和EGF在體外誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，利用免疫熒光技術(shù)進行鑒定。 結(jié)論：利用VEGF、bFGF和EGF可以在體外將大鼠外周血單個核細胞誘導分化為EPC。 3、內(nèi)皮祖細胞移植修復大鼠頸總動脈內(nèi)皮損傷?！　》椒ǎ后w外誘導擴增大鼠EPCs并利用Brdu進行標記。16只雄性SD大鼠，隨機等分為兩組，對照組和EPCs移植組。建立大鼠左頸總動

4、脈拉脫模型，隨后從頸外動脈向頸總動脈的損傷動脈段注入PBS溶液500μL含5×106個體外誘導分化并用Brdu標記的EPCs，保持30 min后松開兩側(cè)的動脈夾以恢復血流；對照組只注入等量的PBS溶液500μL。最后結(jié)扎頸外動脈的游離端并縫合頸中部切口。14 d后取損傷動脈段和對側(cè)的正常動脈。利用病理學、免疫組織化學和圖象分析技術(shù)對修復效果進行評價。 結(jié)論：EPCs可以定植到動脈損傷段并抑制新生內(nèi)膜的生長，說明EPCs具有修復動

5、脈損傷的作用。 4.血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelium growth faetor，VEGF)調(diào)動內(nèi)皮祖細胞修復動脈損傷的實驗研究?！　》椒ǎ簩?2只雄性SD大鼠，隨機等分為兩組：VEGF組和對照組。每組中隨機選8只用于大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細胞拉脫模型的建立，另外8只用于抽血分離外周血單個核細胞以進行細胞培養(yǎng)。用于抽血分離外周血單個核細胞進行細胞培養(yǎng)的大鼠共注射7天藥物，方法為：VEGF組用5 μg／ml

6、的VEGF溶液200 μl／d，腹腔注射；對照組用PBS 200μl／d，腹腔注射。利用流式細胞術(shù)和細胞培養(yǎng)技術(shù)評價外周血中EPC的數(shù)目。用于建立模型的大鼠注射10天藥物，方法為：VEGF組用5 μg／ml的VEGF溶液200 μl／d，腹腔注射；對照組用PBS 200 μl／d，腹腔注射。用于建立動物模型的大鼠，在藥物注射7天時，利用Fogarty球囊導管建立大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細胞拉脫模型。并在手術(shù)后立即斷尾取血100μl，利用流式細

7、胞術(shù)評價外周血中Flk-1+的細胞比例。球囊損傷14天后，取損傷動脈段和對側(cè)正常動脈利用病理學、免疫組織化學、電鏡技術(shù)和圖象分析技術(shù)進行評價。 結(jié)論： VEGF具有調(diào)動EPCs修復動脈損傷的作用。 5.黃連素動員大鼠骨髓EPCs對大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞依賴的舒張功能的影響?！　》椒ǎ?2只雄性SD大鼠采用隨機數(shù)字法等分為兩組：對照組(n=6)和黃連素(Berberine，BR)組(n=6)。對照組每天給予飼養(yǎng)用水2ml灌

8、胃；BR組每天給予15mg／ml的BR溶液45mg／Kg灌胃。藥物共干預6天，第7天用頸椎脫臼法處死大鼠，然后迅速取出胸主動脈約1cm，并從下腔靜脈取肝素抗凝血約5ml。利用流式細胞術(shù)和細胞培養(yǎng)技術(shù)測定BR干預7天后外周血中EPCs的數(shù)目。利用動脈環(huán)試驗評價大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞依賴的動脈舒張功能。 結(jié)論：BR可以調(diào)動大鼠骨髓EPCs，BR調(diào)動骨髓EPCs可能是BR改善內(nèi)皮細胞功能的一種機制。 6.BR動員大鼠骨髓EPCs

9、修復大鼠左頸總動脈內(nèi)皮損傷的研究?！　》椒ǎ?8只雄性SD大鼠建立大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細胞拉脫模型后，采用隨機數(shù)字法等分為三組：對照組(n=6)、BR組(n=6)和BR+L-NAME組(n=6)。動脈內(nèi)皮細胞拉脫術(shù)前4天開始藥物干預，共干預10天。 結(jié)論：BR可以調(diào)動大鼠骨髓EPCs，改善內(nèi)皮細胞功能和加速損傷動脈的再內(nèi)皮化。eNOS／NO系統(tǒng)參與了BR調(diào)動EPCs的過程。 7.BR調(diào)動人體EPCs對內(nèi)皮細胞功能和動脈彈性

10、的影響?！　?方法：20位健康志愿者服用BR 30天，0.4g tid。志愿者服藥前和服藥30天后進行生化指標的測定。受試者在動脈彈性功能測定后臥位休息15 min，然后檢測受試者肱動脈對反應(yīng)性充血的內(nèi)皮依賴血管擴張反應(yīng)(FMD)。服藥前后抽取外周血，利用流式細胞術(shù)和細胞培養(yǎng)技術(shù)測定服藥前后外周血中EPCs數(shù)目的變化 結(jié)論：BR可以調(diào)動人體EPCs，這可能是BR改善內(nèi)皮細胞功能的機制之一。 8.BR對體外培養(yǎng)的EPCs