特異性結(jié)合內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞小分子肽的篩選及其內(nèi)皮化人工血管的研究.pdf

1、背景和意義：
　　心血管疾病是導(dǎo)致人類死亡的首要原因。通過血管移植對(duì)受損血管進(jìn)行替換是治療心血管疾病的主要途徑。然而，當(dāng)前合適的自體血管移植物來源有限，并且生物降解聚合物小口徑人工血管(內(nèi)徑≤5 mm)在移植后由于表面缺乏功能內(nèi)皮化容易發(fā)生血栓及內(nèi)膜增生，從而影響了長(zhǎng)期通暢率。近年來，通過體外在聚合物人工血管表面種植自體細(xì)胞構(gòu)建組織工程血管以提高小口徑人工血管的內(nèi)皮化和長(zhǎng)期通常率得以發(fā)展。然而，體外通過細(xì)胞培養(yǎng)種植構(gòu)建組織工程血管

2、，在細(xì)胞收集和培養(yǎng)方面耗時(shí)、耗力、耗材，且存在較高的風(fēng)險(xiǎn)，因此利用機(jī)體天然再生機(jī)制，構(gòu)建可以自主招募內(nèi)源性細(xì)胞且具有原位血管再生潛能的人工血管成為當(dāng)前研究的主要方向。天然血管中的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于血管的結(jié)構(gòu)和功能有著重要的生理學(xué)功能，且內(nèi)源性的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)和內(nèi)皮細(xì)胞(EC)在新血管形成過程中扮演著重要的角色。因此，當(dāng)前多種功能性的生物分子已經(jīng)被用于修飾聚合物人工血管，構(gòu)建類似于細(xì)胞外基質(zhì)的功能性人工血管表面，從而自主招募內(nèi)源性的EP

3、C和EC。然而，這些功能性分子存在很多弊端，如缺乏對(duì)于EPC和（或）EC結(jié)合的高特異性和高親和力，從而容易導(dǎo)致其它不利細(xì)胞粘附在血管表面形成血栓;缺乏對(duì)于EPC和（或）EC的功能性，難以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和組織的再生;體內(nèi)穩(wěn)定性較低，從而大大降低了其在體內(nèi)的功能性。One-beadone-compound(OBOC)組合文庫技術(shù)是一種高通量的化學(xué)文庫合成及篩選技術(shù)，可以廣泛地用于多種生物功能性受體的配基的合成和篩選。在應(yīng)用OBOC技術(shù)篩選小

4、分子化合物過程中，可以通過設(shè)計(jì)主要功能基團(tuán)周邊氨基酸殘基不同的空間結(jié)構(gòu)，從而提高篩得小分子肽對(duì)于目標(biāo)靶分子結(jié)合的特異性和親和力。同時(shí)，在利用OBOC技術(shù)篩選合成小分子肽的過程中可以引入非天然氨基酸殘基并實(shí)現(xiàn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而大大提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。因此，本課題利用OBOC技術(shù)，針對(duì)對(duì)EPC和(或)EC功能具有重要影響的表面整合素分子，篩選合成對(duì)EPC和（或）EC具有高特異性、高親和力、高功能性且體內(nèi)具有高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的生物小分子肽，并將它穩(wěn)

5、定地修飾于小口徑人工血管支架表面，構(gòu)建生物功能型人工血管。我們進(jìn)一步證實(shí)該生物功能型人工血管移植動(dòng)物體內(nèi)后可以快速有效的招募內(nèi)源性的EPC和（或）EC到血管移植物與血液接觸的管腔表面，同時(shí)抑制其它不利細(xì)胞和蛋白的粘附，從而提高小口徑人工血管的快速內(nèi)皮化和長(zhǎng)期通暢率。
　　內(nèi)容、方法和結(jié)果：
　　1.EPC和EC特異性結(jié)合小分子肽的篩選和鑒定
　　方法:
　　利用OBOC組合文庫技術(shù)合成篩選針對(duì)EPC和（或）EC具

6、有高特異性和高親和力的功能性小分子肽;通過活細(xì)胞與修飾有篩得的小分子肽的樹脂球結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定篩得的小分子肽對(duì)于EPC和EC的結(jié)合的特異性;通過流式細(xì)胞技術(shù)比較篩得的小分子肽與傳統(tǒng)的GRGD對(duì)于EPC和EC的結(jié)合特異性和親和力的差異;通過表面粘附實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定和確定篩得的小分子肽與傳統(tǒng)的GRGD對(duì)于EC的結(jié)合的特異性和親和力的差異;通過測(cè)定αvβ3抗體封閉前后篩得的小分子肽對(duì)于EPC和EC的結(jié)合能力，評(píng)估篩得的小分子肽是否確實(shí)通過細(xì)胞表面整

7、合素αvβ3與EPC和EC結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　利用OBOC組合文庫技術(shù)合成篩選了包含非天然氨基酸殘基和二硫鍵的小分子八肽LXW7(cGRGDdvc);細(xì)胞和修飾有小分子肽的樹脂球結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，LXW7對(duì)于不同來源的EPC和EC具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，并且不結(jié)合THP-1單核細(xì)胞，與血小板結(jié)合非常微弱;流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，與GRGD相比，LXW7具有與不同來源的EPC和EC更強(qiáng)的結(jié)合能力，LXW7和GRGD都不與TH

8、P-1單核細(xì)胞結(jié)合，值得關(guān)注的是，LXW7與血小板結(jié)合非常微弱，但GRGD卻與血小板有較強(qiáng)的結(jié)合;表面粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與GRGD表面相比，EC更容易在LXW7表面粘附，LXW7和GRGD表面都不支持THP-1單核細(xì)胞的粘附，血小板在LXW7表面粘附非常微弱，但在GRGD表面有較強(qiáng)的粘附;整合素αvβ3抗體封閉實(shí)驗(yàn)顯示，αvβ3在不同來源的EPC和EC表面均有很強(qiáng)的表達(dá)，利用αvβ3抗體對(duì)細(xì)胞封閉之前LXW7與EPC和EC都有很強(qiáng)的結(jié)合

9、，但當(dāng)利用αvβ3抗體對(duì)細(xì)胞封閉之后LXW7與EPC和EC的結(jié)合均有顯著下降。這進(jìn)一步確認(rèn)了LXW7是通過整合素αvβ3分子與EPC和EC結(jié)合的。
　　2.LXW7對(duì)于EPC和（或）EC生物學(xué)功能及在體外模擬血流情況下粘附能力的影響
　　方法:
　　利用MTS分析測(cè)定LXW7對(duì)于EPC和EC增殖能力的影響;利用Western-blot測(cè)定LXW7對(duì)于EPC和EC功能相關(guān)的重要信號(hào)通路的影響;利用qPCR測(cè)定LXW7對(duì)于

10、EPC分化成熟能力的影響;體外構(gòu)建血流模擬裝置，并利用其分別測(cè)定比較在血流剪切力存在的情況下EC在LXW7和纖維連接蛋白表面的滯留情況。
　　結(jié)果:
　　MTS測(cè)定結(jié)果顯示，與在正常表面培養(yǎng)的EPC和EC相比，在LXW7表面培養(yǎng)的EPC和EC的增殖能力均有提高，但當(dāng)將EPC和EC在LXW7表面培養(yǎng)一段時(shí)間然后將EPC和EC脫離LXW7表面自行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的增殖能力與在正常表面培養(yǎng)的EPC和EC相比并無差異;Western-b

11、lot結(jié)果顯示，LXW7可以提高EC內(nèi)VEGFR2的磷酸化，從而進(jìn)一步提高細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化，同時(shí)LXW7也可以提高EPC內(nèi)ERK1/2的磷酸化;qPCR結(jié)果顯示，利用LXW7處理后，EPC表達(dá)KDR、NOS3、CD144、vWF、JAG1、DLL1和HEY1無顯著性變化，與成熟的EC相比，EPC表達(dá)KDR偏高，其它普遍偏低。在血流剪切力存在的情況下，EC可以在LXW7表面很好地滯留，并且強(qiáng)于EC在纖維連接蛋白表面的滯留。

12、>　　3.功能型人工血管的構(gòu)建
　　方法:
　　利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建人工血管支架;設(shè)計(jì)合成不影響LXW7結(jié)構(gòu)和功能且有利于化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的LXW7衍生物;通過“click chemistry”方法將LXW7固定于人工血管支架表面;利用全反射-傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜技術(shù)和氨基酸分析技術(shù)測(cè)定LXW7在人工血管支架表面的固定情況;體外測(cè)定EC在小分子肽修飾后的人工血管支架表面的粘附、增殖和鋪展情況。
　　結(jié)果:
　　選取19

13、％聚乳酸(PLLA)和5％聚己內(nèi)酯(PCL)的混合物為原料，利用靜電紡絲技術(shù)成功構(gòu)建出結(jié)構(gòu)類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)且機(jī)械強(qiáng)度與天然動(dòng)脈血管相似的人工血管支架;成功合成不影響LXW7功能且有利于化學(xué)反應(yīng)的LXW7生物素衍生物，并利用優(yōu)化后的“click chemistry”反應(yīng)體系將LXW7成功固定于人工血管支架表面;全反射-傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜技術(shù)(ATR-FTIR)和氨基酸分析技術(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，LXW7已被高效地固定于人工血管支架表面;體外

14、測(cè)定結(jié)果顯示，與未經(jīng)修飾的人工血管支架相比，LXW7修飾后的人工血管支架表面對(duì)EC的粘附有顯著的提高，對(duì)EC的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)，并且支持EC的鋪展。
　　4.功能型人工血管體內(nèi)的內(nèi)皮化和通暢率研究
　　方法:利用Sprague-Dawley(SD)大鼠的左側(cè)頸總動(dòng)脈為模型，分別在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定LXW7表面修飾的功能型人工血管的內(nèi)皮化程度和通暢率;并通過免疫組織化學(xué)進(jìn)一步分析功能型人工血管在體內(nèi)對(duì)于內(nèi)源性EPC和EC的招募程度

15、，以及功能型人工血管自身的內(nèi)皮化速度和內(nèi)皮覆蓋率。
　　結(jié)果:
　　不同時(shí)間點(diǎn)通暢率測(cè)定結(jié)果顯示，1周時(shí)，LXW7修飾組中，6只移植物全部保持通暢(100％)，而未修飾組中卻有一半已經(jīng)堵塞，只剩3只保持通暢(50％);2周時(shí)，LXW7修飾組中有5只保持通暢(83.3％)，而未修飾組中只剩1只保持通暢(16.7％);6周時(shí)，LXW7修飾組中依然有5只保持通暢(83.3％)，而未修飾組中只有1只保持通暢(16.7％)。血管移植物

16、內(nèi)表面En face免疫熒光染色結(jié)果顯示，1周時(shí)，LXW7修飾后的移植物已經(jīng)有大量的細(xì)胞粘附，而未經(jīng)修飾的移植物幾乎無細(xì)胞粘附;2周時(shí)，LXW7修飾后的移植物細(xì)胞覆蓋率迅速增加并且有組織化發(fā)生，而未修飾的移植物只有少量細(xì)胞粘附;6周時(shí)，LXW7修飾后的移植物幾乎完全被細(xì)胞覆蓋并且移植物整體正在逐漸實(shí)現(xiàn)組織化，而未經(jīng)修飾的移植物細(xì)胞粘附程度相對(duì)較弱;經(jīng)過對(duì)EPC表面標(biāo)記CD34和EC表面標(biāo)記CD31的熒光染色分析，結(jié)果顯示，1周時(shí)，LXW

17、7修飾后的移植物兩端已經(jīng)有大量的EC覆蓋，與此同時(shí)，移植物中部和兩端都有大量的EPC粘附，然而未經(jīng)修飾的移植物幾乎無細(xì)胞粘附;2周時(shí)，LXW7修飾后的移植物幾乎已經(jīng)完全被EC覆蓋，并且同時(shí)依舊伴隨對(duì)EPC的招募，而未修飾的移植物只有非常少量EC粘附并且缺乏對(duì)于EPC的招募功能;6周時(shí)，LXW7修飾后的移植物完全被EC覆蓋，并且沒有新招募的EPC，而未經(jīng)修飾的移植物EC覆蓋程度相對(duì)較低。人工血管移植物移植6周后，LXW7修飾后的人工血管表

18、面有大量的微血管和（或）毛細(xì)血管生成，而未修飾的人工血管表面幾乎無新生血管生成。移植6周后，HE染色結(jié)果顯示，LXW7修飾后的人工血管具有較好通暢率，管壁只有微量血栓形成，而未經(jīng)修飾的人工血管已幾乎堵塞，有大量的血栓形成;移植6周后，對(duì)LXW7修飾后的移植物橫切面針對(duì)EC表面的標(biāo)記蛋白CD31熒光染色，結(jié)果顯示，移植物的內(nèi)壁和外壁都有大量的EC覆蓋，且有大量的EC已經(jīng)遷移至血管移植物的內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　本課題通

19、過解決當(dāng)前小口徑人工血管構(gòu)建過程中存在的主要問題，成功構(gòu)建功能型小口徑人工血管，并在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)小口徑人工血管自身的快速內(nèi)皮化并獲得長(zhǎng)期通暢率，為設(shè)計(jì)和發(fā)展功能型小口徑人工血管提供了新的思路，提高了臨床應(yīng)用的可行性，為心血管疾病的治療提供了新的手段。
　　(1)利用OBOC組合文庫技術(shù)合成篩選得到了對(duì)EPCs和（或）ECs具有高特異性、高親和力、高功能性和高體內(nèi)穩(wěn)定性的生物功能小分子肽LXW7。
　　(2)在血流剪切力存在的情況

20、下，EC在修飾有LXW7的表面依然可以很好地滯留，并且強(qiáng)于在纖維連接蛋白表面的滯留。
　　(3)通過優(yōu)化選擇構(gòu)建人工血管支架的聚合物材料，利用靜電紡絲技術(shù)，構(gòu)建出具有與天然細(xì)胞外基質(zhì)相似、與天然動(dòng)脈血管機(jī)械強(qiáng)度接近的人工血管支架。
　　(4)優(yōu)化設(shè)計(jì)出穩(wěn)定高效的“click chemistry”反應(yīng)體系，將LXW7高效穩(wěn)定地固定于人工血管支架表面，成功構(gòu)建功能型人工血管。
　　(5)體內(nèi)測(cè)定證明所構(gòu)建的功能型人工血管實(shí)