內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合肽的篩選及生物信息分析.pdf

1、膿毒癥是指各種致病微生物或其毒素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、大手術(shù)后等臨床危重患者死亡的主要原因。其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞感染、炎癥、免疫功能紊亂、凝血功能障礙及組織損害等一系列問題。膿毒癥進(jìn)一步可發(fā)展成膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征后，治療更困難、預(yù)后很惡劣。
　　內(nèi)毒素(endotoxin)是引起膿毒癥的主要因素，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(LPS)。在全身炎癥反應(yīng)綜合征及膿毒癥發(fā)病機(jī)制的研究中，目前較

2、為公認(rèn)的是“二級炎癥反應(yīng)理論”:LPS首先誘發(fā)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，后者進(jìn)一步激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種效應(yīng)細(xì)胞，并形成瀑布效應(yīng)，使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大甚至失去控制，最終導(dǎo)致以細(xì)胞自身破壞為特征的全身性炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)過程中，LPS激活內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而使凝血和纖溶系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)激活，并通過粒細(xì)胞和內(nèi)皮組織相互作用，促進(jìn)微循環(huán)障礙惡化。因此，在炎癥反應(yīng)過程中對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行深入研究和有效干預(yù)，則有望減輕炎癥級聯(lián)反應(yīng)。內(nèi)皮

3、細(xì)胞在受到LPS誘導(dǎo)刺激后，自身的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞表面一些與炎癥相關(guān)的分子表達(dá)增多或暴露其相應(yīng)的活性結(jié)構(gòu)部位。與正常內(nèi)皮細(xì)胞相比，受刺激的細(xì)胞表面存在著數(shù)量或/和結(jié)構(gòu)上具有差異的分子，這些分子可能是炎癥級聯(lián)反應(yīng)時某些重要炎癥介質(zhì)的結(jié)合位點，尋找到這些差異分子的特異性結(jié)合肽，則有可能通過競爭性抑制相應(yīng)炎癥介質(zhì)與效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)而中和或阻斷這些炎癥介質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)，達(dá)到阻斷或減輕全身性炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
　　細(xì)胞是一個復(fù)雜

4、的生物體系，表面分布著大量的信號分子，可反映細(xì)胞的特性及所處的功能狀態(tài)。雖然可將這些分子純化作為靶標(biāo)來篩選細(xì)胞特異性的結(jié)合肽，但純化這些分子相當(dāng)困難。而完整細(xì)胞篩選不需事先知道有關(guān)受體的信息，對某種特定狀態(tài)下細(xì)胞膜表面差異分子的篩選非常有利，既可保持細(xì)胞表面表達(dá)的受體的完整構(gòu)象和生物學(xué)活性，又能充分模擬自然條件下蛋白質(zhì)分子間的相互作用，從而有效尋找到特異性結(jié)合于細(xì)胞表面的標(biāo)志蛋白和鑒定細(xì)胞特異標(biāo)志。但是，由于完整細(xì)胞的膜表面抗原密度很低

5、，給抗體篩選帶來了一定難度，也存在非特異性大、背景值高、洗滌過程中特異性配體損失等不利因素，很難獲得針對某一抗原的單鏈抗體。
　　噬菌體展示技術(shù)就為尋找這些差異分子的特異性結(jié)合肽提供了有效的技術(shù)手段。為了解決上述問題，并盡可能接近體內(nèi)環(huán)境，選用Giordano等新建立的用于細(xì)胞差減篩選的“生物淘篩和對篩選出的反應(yīng)配體的快速分析(BRASIL)”技術(shù)，順利地完成了本課題的篩選工作。
　　在分析這些特異性結(jié)合肽的同時，成功地建立