抗內(nèi)皮細胞抗體介導的內(nèi)皮細胞損傷機制.pdf

1、目的： 研究AECA對內(nèi)皮細胞凋亡和分泌細胞因子的影響，探討AECA損傷內(nèi)皮細胞的機制，進一步驗證α-烯醇化酶是AECA識別的自身抗原之一。 方法： 以EA.hy926細胞提取物蛋白為抗原，免疫印跡法檢測并篩選47kD-AECA強陽性患者血清，G蛋白親和層析法純化IgG，用純化蛋白體外誘導內(nèi)皮細胞凋亡，應用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測細胞凋亡，并觀察重組抗原(α-烯醇化酶)對凋亡的阻斷作用；應用ELISA法檢測含4

2、7kD-AECA IgG體外作用于內(nèi)皮細胞后，上清液中IL-6的水平。 結(jié)果： 1．含47kD-AECA IgG體外可誘導內(nèi)皮細胞凋亡，經(jīng)Hoechst 33342染色后熒光顯微鏡下可見明顯的核形態(tài)變化及典型的凋亡小體； 2．800gg/ml含47kD-AECA SLE IgG分別作用于EA.hy926細胞24、48和72小時后，凋亡率分別為5.59％、11.4％和50.2％，48及72小時后出現(xiàn)較明顯的亞G1凋

3、亡峰，此時的凋亡率明顯高于加入相同劑量正常人IgG的內(nèi)皮細胞凋亡率(分別為2.71％、2.24％和4.27％)；而同時加入相同劑量經(jīng)重組α-烯醇化酶預處理的含47kD-AECA IgG，內(nèi)皮細胞的凋亡率明顯降低(分別為2.32％、7.60％和8.58％)。 3．含47kD-AECA IgG作用于EA.hy926細胞8小時后，Annexin V<'+>細胞數(shù)明顯增加，并隨IgG作用時間和濃度的增加而升高，提示AECA可誘導膜磷脂酰

4、絲氨酸(PS)外翻表達于細胞表面； 4．800gg/ml含47kD-AECA的4例患者IgG作用于EA.hy926細胞 24小時后，Annexin V<'+>細胞分別為21.1％、17.9％、16.6％、24.2％，明顯高于正常對照組的Annexin V<'+>細胞(6.04％)；而800μg/ml經(jīng)重組α-烯醇化酶預處理的含47kD-AECA IgG作用于EA.hy926細胞24小時后，Annexin V<'+>細胞有所減少，

5、分別為12.0％、10.7％、11.3％、10.1％；提示重組α-烯醇化酶可部分阻斷含47kD-AECA體外誘導內(nèi)皮細胞凋亡的作用。 5．不同濃度含47kD-AECA IgG作用于EA.hy926細胞24小時后，上清液中IL-6平均水平較正常對照組明顯升高，分別為16.09 vs 5.297 pg/ml(200ug/ml IgG)、24.59 vs 6.278 pg/ml(400ug/ml IgG)、 34.73 vs 8.049 pg

6、/ml(600ug/ml IgG)、48.55 vs 8.484 pg/ml(800ug/ml IgG)，且隨IgG濃度增加呈上升趨勢；提示AECA體外可促使內(nèi)皮細胞分泌IL-6增加，并呈現(xiàn)濃度相關性。 結(jié)論： 1．AECA體外可誘導內(nèi)皮細胞凋亡，早期可出現(xiàn)細胞膜的結(jié)構成分磷脂酰絲氨酸(PS)的暴露。 2．AECA體外可促使內(nèi)皮細胞分泌促炎癥細胞因子IL-6，引起內(nèi)皮細胞損傷。 3．重組α-烯醇化酶可部分