血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-2(ECSM2)對血管新生作用的研究.pdf

1、目的：探討內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子2（ECSM2）的功能學(xué)表位，ECSM2與其他內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子之間的關(guān)系，ECSM2對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，以及ECSM2分子在血管新生性疾病組織中的表達(dá)。
　　方法：
　　1.利用CBS Prediction Servers生物信息學(xué)軟件預(yù)測ECSM2分子功能學(xué)表位；通過定點(diǎn)PCR突變技術(shù)將胞外段第54位酪氨酸突變?yōu)楸彼幔╕54A），構(gòu)建表達(dá)Y54A突變的ECSM2真核表達(dá)載體p ECSM2

2、Y54A GFP和pECSM2 Y54A3FLAG。
　　2.將真核表達(dá)ECSM2 wild type和Y54A突變的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過免疫熒光和免疫共沉淀明確 ECSM2分子的膜定位和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)；通過劃痕實(shí)驗(yàn)和跨孔實(shí)驗(yàn)檢測ECSM2分子對細(xì)胞遷移的影響。
　　3.用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，利用免疫印跡和免疫共沉淀檢測ECSM2分子與VE-Cadherin分子之間的關(guān)

3、系。
　　4.將HUVEC細(xì)胞接種Matrigel，用Real Time PCR檢測體外血管新生過程中ecsm2基因表達(dá)水平的變化；用siRNA干擾技術(shù)抑制ecsm2基因表達(dá)，用Tube formation assay和in vitro permeability assay觀察對體外血管形成及血管穩(wěn)定性的影響。
　　5.收集46例肝臟惡性腫瘤標(biāo)本（包括腫瘤組織和癌旁組織），做免疫組化分析，結(jié)合病人資料采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件

4、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1. ECSM2分子胞外段潛在功能位點(diǎn)為1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（Y54，tyrosine）、12個(gè)絲/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、1個(gè) N-糖基化（N96，Asparagine）和23個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。胞內(nèi)段有7個(gè)可能的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)。
　　2. ECSM2分子胞外段第54位酪氨酸殘基突變（Y54A）不影響ECSM2分子的膜定位；該位點(diǎn)被證實(shí)為酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。Y54A突變解除了ECSM2分子對細(xì)

5、胞遷移的抑制。
　　3. VEGF刺激HUVEC，促進(jìn)ECSM2與VE-cadherin分子間結(jié)合。
　　4. ECSM2分子在體外血管形成中轉(zhuǎn)錄水平降低，與血管穩(wěn)定性維持相關(guān)。
　　5. ECSM2在肝臟惡性腫瘤組織中表達(dá)水平升高。
　　結(jié)論：ECSM2分子第54位酪氨酸殘基是酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變不影響ECSM2分子膜定位，但阻遏了ECSM2對生長因子誘導(dǎo)性細(xì)胞遷移的抑制，提示該位點(diǎn)參與ECSM2分子對