內(nèi)皮祖細胞在嬰兒肺損傷修復(fù)中的作用及其機制研究.pdf

1、前言
　　 許多嚴(yán)重的小兒肺部疾病都存在著血管損傷。如小兒急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、新生兒呼吸窘迫綜合征(RDS)、胎糞吸入綜合征(MAS)、支氣管肺發(fā)育不良(BPD)等兒童期疾病，均是威脅小兒生命和影響長期生存質(zhì)量的常見臨床危重癥和嚴(yán)重慢性疾??；微血管內(nèi)皮受損和功能障礙是這些疾病共同的啟動因素和病理特征，血管內(nèi)皮的正常修復(fù)是治療的關(guān)鍵所在。因此，促進受損肺血管的正常發(fā)育和損傷后修復(fù)，是治療小兒階段肺

2、損傷的新策略。內(nèi)皮祖細胞(EPC)是血管內(nèi)皮的前體細胞，主要來源于骨髓，具有自我更新和高度增殖的能力，可以在某些生理或病理因素刺激下，動員至外周血循環(huán)并歸巢至損傷組織局部，促進血管的新生和修復(fù)。以往關(guān)于EPC的研究主要集中在心腦血管疾病領(lǐng)域。近年來，一些學(xué)者開始關(guān)注EPC在肺部疾病發(fā)病機理和治療中的作用。但這些研究主要集中在成人的肺部疾病中，對小兒肺疾病領(lǐng)域的研究很少。因此，我們進行了RDS新生兒循環(huán)EPC和相關(guān)動員因子水平的臨床研究：

3、并圍繞ALI時EPC的動員機制、外源性干預(yù)促進EPC動員、EPC促進肺損傷修復(fù)的機制等EPC治療中的重要問題，開展了動物實驗研究；希望通過我們的研究，能夠為理解EPC在嬰兒肺損傷及修復(fù)中的作用帶來一些幫助，同時為基于EPC的ALI臨床治療提供一些思路。
　　 第一部分 RDS新生兒外周血CD34+細胞水平及與預(yù)后的關(guān)系研究
　　 背景：盡管廣泛應(yīng)用了肺表面活性物質(zhì)和肺保護性通氣策略治療，RDS仍是影響早產(chǎn)兒發(fā)病率和死亡率

4、的重要疾病。機械通氣、高氧等治療又會對肺泡和血管造成急性、慢性的損傷，從而導(dǎo)致BPD的發(fā)生。循環(huán)干/祖細胞在成人肺損傷修復(fù)中的作用已受到關(guān)注并得到許多研究的證實，而在新生兒中的相關(guān)研究很少。最近的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，高氧暴露降低了循環(huán)EPC的數(shù)目，從而破壞了肺血管發(fā)育，導(dǎo)致BPD的發(fā)生，臨床研究發(fā)現(xiàn)出生時循環(huán)EPC低的早產(chǎn)兒隨后發(fā)生BPD的風(fēng)險增加，但循環(huán)干/祖細胞在RDS新生兒中的變化及對臨床預(yù)后的影響還不清楚。
　　 目的：研

5、究RDS新生兒外周血CD34+細胞水平及其相關(guān)動員因子的變化；分析外周血CD34+細胞水平與臨床預(yù)后的關(guān)系。
　　 方法：研究對象選取我院NICU病房住院的RDS患兒，同時選取無彌散性肺疾病的住院早產(chǎn)兒作為早產(chǎn)對照，無彌散性肺疾病的住院足月兒作為足月對照。采用流式細胞儀檢測研究對象外周血CD34+細胞水平，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿動員因子[粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)

6、和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)]的水平。同時記錄臨床資料，分析CD34+細胞及動員因子水平與預(yù)后的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：共納入RDS新生兒41名，早產(chǎn)對照兒20名，足月對照兒14名。RDS患兒的外周血CD34+細胞數(shù)目明顯高于早產(chǎn)[25(6-174)vs.15(1-100)個/μl；P<0.05]和足月對照患兒。對RDS患兒的比較發(fā)現(xiàn)，CD34+細胞水平與入院時SNAPPE-Ⅱ呈負(fù)相關(guān)(r=-0.473，P<0.01)；存活RD

7、S患兒CD34+水平高于死亡患兒[26(6-174)vs.4(8-11)個/μl；P<0.05)；CD34+水平低的患兒機械通氣時間長(r=-0.396，P<0.05)。RDS患兒外周血SDF-1水平高于早產(chǎn)(12.6±1.8 vs.9.6±1.8 ng/ml，P<0.01)和足月對照患兒，且SDF-1水平與CD34+細胞水平成正相關(guān)(r=0.305，P<0.01)。對不同胎齡新生兒外周血CD34+細胞數(shù)目的比較發(fā)現(xiàn)，胎齡越小，外周血C

8、D34+細胞數(shù)目越高，兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.373，P<0.05)。
　　 結(jié)論：RDS患兒外周血CD34+細胞水平升高，并且與預(yù)后改善相關(guān)；外周血SDF-1水平與CD34+細胞的水平呈正相關(guān)；提示升高的CD34+細胞水平促進了肺損傷修復(fù)，SDF-1參與了CD34+細胞的動員。
　　 第二部分吸入NO對急性肺損傷幼豬循環(huán)EPC水平及修復(fù)的影響
　　 背景：ALI/ARDS是嚴(yán)重威脅各年齡層人群的臨床危重癥，AR

9、DS是ALI的晚期階段，小兒各年齡均會發(fā)生ALI/ARDS，以嬰幼兒多見，是小兒呼吸危重病的主要死因之一。在發(fā)達國家，近年來肺保護性通氣策略的應(yīng)用使ALI/ARDS的病死率有所下降，但仍高達40％。在我國，2004我們對全國25家兒童醫(yī)院的調(diào)查顯示，小兒ARDS的病死率為61％，2005-2006年新的流行病學(xué)調(diào)查顯示ARDS病死率有所降低，但仍高達44.8％。因此，仍需研究和探索ALI/ARDS的發(fā)病機制及新的治療方法。微血管內(nèi)皮細胞

10、受損從而導(dǎo)致通透性增加是ALI/ARDS主要的病理學(xué)特征之一，因此促進損傷血管的修復(fù)可能是降低高死亡率的一個關(guān)鍵點。對成人肺損傷的研究顯示，EPC與ARDS患者存活率呈正相關(guān)；動物實驗中顯示外源性輸入EPC可以在肺損傷局部定植增殖，參與損傷血管內(nèi)皮細胞的生成和修復(fù)。但外源性細胞移植需時長，臨床治療可行性差，因此促進內(nèi)源性EPC動員可能是更加可行的治療方法。已有研究證實一氧化氮(NO)是骨髓EPC動員通路中的關(guān)鍵分子，相關(guān)研究也提示eNO

11、S/NO信號可能介導(dǎo)了循環(huán)EPC的歸巢。外源性NO吸入能迅速彌散入血，作用局限于肺；同時可以通過SNO產(chǎn)生循環(huán)效應(yīng)。吸入NO是否可以促進骨髓的EPC的動員及肺組織局部歸巢仍不清楚，對這一問題的研究將為EPC在小兒ALI中的治療帶來新的思路。目的建立幼豬不同程度肺損傷動物模型，比較不同程度肺損傷時外周血、骨髓EPC水平的變化；研究吸入NO后外周血、骨髓EPC水平的變化及對肺損傷修復(fù)的影響；探討EPC的動員、歸巢機制。
　　 方法：

12、健康幼豬(3-4周齡、體重7-10kg)26只，經(jīng)鎮(zhèn)靜麻醉后給予氣管插管和小潮氣量(6-8 ml/kg)機械通氣并動靜脈置管。ALI模型通過靜脈注射不同劑量油酸誘發(fā)形成。實驗動物隨機分為5組：對照組(C)：單純機械通氣；中度ALI組(M)：靜脈注入0.08-0.09 ml/kg油酸造成中度ALI，機械通氣；嚴(yán)重ALI組(SM)：靜脈注入0.13-0.15 ml/kg油酸造成嚴(yán)重ALI，機械通氣；嚴(yán)重ALI+G-CSF組(GM)：嚴(yán)重AL

13、I基礎(chǔ)上，給予皮下注射G-CSF連續(xù)7天(10μg/kg)；嚴(yán)重ALI+吸入NO組(NM)：嚴(yán)重ALI基礎(chǔ)上給予吸入NO(10 ppm)直至機械通氣停止。(中度ALI判斷標(biāo)準(zhǔn)：動脈血氧分壓/吸入氧濃度(PaO2/FiO2)≤300mmHg；呼吸系統(tǒng)動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)較基礎(chǔ)狀態(tài)下降30％以上。嚴(yán)重ALI判斷標(biāo)準(zhǔn)：PaO2/FiO2≤200mmHg；Cdyn較基礎(chǔ)狀態(tài)下降50％以上。)實驗期間給予動物常規(guī)性補液、糾正低血壓、酸中毒、電解

14、質(zhì)紊亂等，調(diào)節(jié)吸入氧濃度(FiO2)、呼吸頻率(RR)保持PaO2>60 mmHg、PaCO2介于35與45 mmHg間，機械通氣24-72小時至動物病情好轉(zhuǎn)，撤離呼吸機飼養(yǎng)至168小時。治療觀察期間，監(jiān)測心率(HR)、血氣(pH、PaO2、PaCO2、BE等)、血流動力學(xué)[心輸出量(CO)、平均動脈壓(MABP)、左心室收縮力指數(shù)(dp/dtmax)等]和肺水指標(biāo)(EVLW、ELWI)和呼吸力學(xué)參數(shù)[吸氣峰壓(PIP)、平均氣道壓(M

15、AP)、RR、FiO2、Cdyn]，并計算氧合指數(shù)(OI=MAP×FiO2x100/PaO2)、PaO2/FiO2比值、肺泡-動脈氧分壓差(Aa-DO2)等。分別于實驗基礎(chǔ)值(B)，成模時(0 h)，24小時(h)，72 h，168 h留取外周血、骨髓標(biāo)本，檢測血常規(guī)、EPC、血漿動員因子(SDF-1、VEGF、SCF)及炎癥因子水平(IL-6、IL-8、IL-10)；實驗結(jié)束處死動物，取右肺中葉測濕/干重比(W/D)，另留肺組織測(C

16、D34、KDR、CD133、VEGF、VEGFR2、SDF-1、CXCR4)mRNA表達，收集右肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)測總蛋白(TP)；左肺行病理形態(tài)學(xué)檢查和肺損傷評分，肺組織免疫組織化學(xué)檢測VEGFR2、eNOS、肺血管密度、細胞凋亡等；骨髓切片檢測骨髓病理，骨髓液檢測NO含量及MMP-9活性。
　　 結(jié)果：各組動物體重、性別、基礎(chǔ)血氣值無差異。為便于分析，我們根據(jù)研究目的將結(jié)果分為不同程度肺損傷組和嚴(yán)重肺損傷不同干預(yù)

17、組兩部分來比較。
　　 1.氧合和呼吸力學(xué)：
　　 a)各組的基礎(chǔ)OI值、PaO2/FiO2及A-aDO2均無差異。在不同程度肺損傷組，成模后不同時點(0h，2h，6h)SM組和M組的OI值均明顯高于C組(P<0.05)。在12 h點，SM組OI值高于C組，但與M組差異不明顯；12 h后各組差異不明顯。PaO2/FiO2與OI變化趨勢相同。SM組A-aDO2值在2h、6h、12h點明顯高于C組，其他時點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

18、SM組A-aDO2值在2h和6h明顯高于M組。在嚴(yán)重肺損傷不同干預(yù)組，成模時三組的OI值、PaOE/FiO2及A-aDO2均無差異。在隨后的時點中，NM組OI值較SM組有改善趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。A-aDO2在2 h、6 h和12 h無統(tǒng)計學(xué)差異；在24 h，NM組A-aDO2較SM組明顯改善(P<0.05)。
　　 b)呼吸力學(xué)：各組間基礎(chǔ)狀態(tài)Cdyn及Vd/Vt均無差異。在不同程度肺損傷組，從成模到2 h間，SM組Cdyn均

19、明顯低于C組和M組。其余時點三組間的差異不明顯。SM組2 h的Vd/Vt明顯高于C組(P<0.05)，其余時點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在嚴(yán)重肺損傷不同干預(yù)組，0h點的Cdyn及Vd/Vt值無差異；隨后的時點中，NM及GM組Cdyn均較SM組有改善趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。12 h和24 h，NM組的Vd/Vt值較SM組明顯改善(P<0.05)。
　　 2.血流動力學(xué)及肺水指標(biāo)：
　　 a)CO及MABP：各組動物成模時CO較基

20、礎(chǔ)值有所下降，但不同時點的變化無統(tǒng)計學(xué)差異。各組的不同時點MABP動態(tài)變化無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 b)EVLW、ELWI和PVPI：各組間EVIW、ELWI和PVPI的基礎(chǔ)值均無差異。在不同程度肺損傷組，SM組2 h的EVLW較C組明顯增高；2 h、6 h、12 h點SM組ELWI均較C組明顯升高，隨著實驗時間的延長差異減小。PVPI結(jié)果顯示，2 h時SM組和M組均較C組明顯升高；隨后的時點中，6 h和12 h點SM組PVPI較M

21、組明顯增高。在嚴(yán)重肺損傷不同干預(yù)組，成模時各組指標(biāo)無差異。在24 h時，NM組的ELWI、PVPI均較SM組有顯著改善(P<0.05)。
　　 3.不同程度肺損傷的EPC水平：分別進行了CD34+細胞水平和CD34+KDR+、KDR+CD133+和CD34+CD133+KDR+及CD133+四種不同組合的細胞水平的分析。
　　 a)外周血EPC水平：各組外周血EPC比例基礎(chǔ)值無差異。M組成模時CD34+及CD34+KDR

22、+細胞比例高于C組；24 h M組中各標(biāo)記組合的細胞比例均高于C組，CD34+KDR+和KDR+CD133+細胞比例高于SM組；隨后的時點中差異變小。外周血EPC數(shù)目基礎(chǔ)值無差異，各組不同時點的變化與外周血EPC比例趨勢一致。
　　 b)骨髓EPC水平：基礎(chǔ)狀態(tài)時各組骨髓EPC比例無差異。24 h時，SM組各標(biāo)記組合的細胞比例均高于C組，KDR+CD133+細胞和CD133+細胞比例高于M組(P<0.05)。
　　 c)

23、肺組織EPC水平：M組肺組織CD34 mRNA含量明顯高于SM組和C組；M組KDR、CD133的mRNA含量有高于SM組和C組的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.吸入NO對循環(huán)EPC及肺損傷修復(fù)的影響：
　　 a)外周血EPC水平：各組基礎(chǔ)值無差異。成模時和隨后的時點中，NM組CD34+細胞、CD34+KDR+細胞、KDR+CD133+細胞和CD133+細胞比例有高于C組和SM組的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；168 h

24、 NM組CD34+細胞比例高于SM組。NM組成模時CD34+細胞數(shù)高于SM組；24 h點NM組CD34+細胞、CD34+KDR+細胞和KDR+CD133+細胞數(shù)均高于SM組(P<0.05)；168 h時，NM組CD34+KDR+細胞和KDR+CD133+細胞數(shù)高于SM組。
　　 b)骨髓EPC水平：各組基礎(chǔ)值比較無差異。24 h點NM組和GM組各組合細胞比例均較SM組有下降趨勢。
　　 c)肺組織EPC水平：NM組肺組織

25、CD34、KDR的mRNA表達明顯高于C組和SM組。GM組CD34、KDR的mRNA表達也有高于SM組趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 d)血漿動員因子：M組24 h血漿SDF-1水平明顯高于SM組和C組。NM組72 h點SDF-1和VEGF水平均高于SM組和C組。
　　 e)血漿炎癥因子：各組不同時點IL-6和IL-10的變化無統(tǒng)計學(xué)差異。GM組中不同時點的比較顯示，24 h點IL-8水平較基礎(chǔ)值明顯上升，在隨后的時點

26、逐漸下降。
　　 f)骨髓動員相關(guān)介質(zhì)
　　 1)SM組和M組24 h骨髓NO含量均低于C組。72h，NM組骨髓NO較SM組和GM組高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2)SM組和C組24 h、72 h的MMP-9水平均有下降；NM組72 h MMP-9水平明顯升高。
　　 3)24 h點SM組SCF明顯低于M組(P<0.05)；NM組SCF較SM組明顯升高。
　　 g)肺組織細胞因子及受體表達：NM組

27、肺組織VEGF和SDF-1的mRNA含量均高于SM組和C組(P<0.05)；CXCR4的mRNA含量在NM組也稍高于SM組和C組，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化顯示NM組VEGFR2和eNOS的表達也明顯高于C組和SM組。
　　 h)肺損傷修復(fù)指標(biāo)：NM組肺損傷病理明顯輕于SM組，肺損傷評分低。同時，與SM組相比，NM組肺血管密度明顯增加、肺通透性指數(shù)(LPI)降低、肺組織細胞凋亡減少。
　　 結(jié)論：成功制備了不同油酸劑量