高濃度葡萄糖促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞活性氧升高的機(jī)制探討.pdf

1、血糖升高是糖尿病的主要特點(diǎn)之一。動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，氧化應(yīng)激在此過程中起重要作用。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生過多超過了機(jī)體自身的清除能力從而在體內(nèi)蓄積導(dǎo)致機(jī)體損傷。機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生ROS主要有以下五種途徑：黃嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶（NOX）、線粒體電子傳遞鏈、一氧化氮合酶及脂氧合酶，其中NOX可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的主要來源。吞噬型NADPH氧化酶是由多個(gè)亞基組成的酶復(fù)合體，主要包括胞膜組分：細(xì)胞色素b558

2、（gp91phox和p22phox）和胞漿組分：p47phox、p67phox及Rac（小的GTP結(jié)合蛋白）共五個(gè)亞組分。Gp91phox（有NADPH、heme、FAD的潛在結(jié)合位點(diǎn)）和p22phox是NOX的酶促核心，它們受p47phox及Rac的調(diào)節(jié)。近幾年在對(duì)各種組織的研究中發(fā)現(xiàn)NOX有5種同源家族體，分別稱為NOX1、NOX2（gp91phox）、NOX3、NOX4和NOX5，血管內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)其中的NOX2和NOX4，且N

3、OX4表達(dá)水平比NOX2高約20倍。進(jìn)一步的研究顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的ROS主要來源于NOX4。研究表明，高濃度葡萄糖能夠通過上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中NOX4的表達(dá)，引起ROS升高，而NOX抑制劑能夠抑制葡萄糖的這種作用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)NOX的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了探討。 目的:探討高糖處理HUVECs時(shí)ROS水平的改變及其主要生成途徑，觀察NOX亞組分表達(dá)的變化并研究NOX的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法:用Ⅱ型膠

4、原酶消化分離培養(yǎng)HUVECs，在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)。免疫熒光法檢測(cè)HUVECs內(nèi)第Ⅷ因子相關(guān)抗原的表達(dá)；RT-PCR、Real-time PCR和western blot分析NOX及其亞單位表達(dá)的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平；免疫熒光法觀察NOX亞組分p47phox的細(xì)胞內(nèi)定位。 結(jié)果:分離得到的HUVECs均表達(dá)第Ⅷ因子相關(guān)抗原；高糖處理HUVECs后細(xì)胞內(nèi)ROS升高、NOX4表達(dá)明顯上調(diào)；NOX抑制劑DPI能夠

5、抑制NOX4表達(dá)的上調(diào)和細(xì)胞內(nèi)ROS的升高；在ROS產(chǎn)生過程中p47phox向核膜移位，Apocynin(p47phox抑制劑)能夠抑制p47phox的核膜移位、ROS的升高及NOX4的上調(diào)；PMA(PKC激動(dòng)劑)通過促進(jìn)p47phox向核膜移位誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，Hyperinin(PKC抑制劑)能抑制這種作用。 結(jié)論:高糖處理HUVECs時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS升高主要來源于NADPH氧化酶；高糖上調(diào)HUVECs內(nèi)NOX4表達(dá)；高糖通過