葡萄糖濃度漂移對血管內(nèi)皮細(xì)胞傷害程度及機(jī)制的研究.pdf

1、糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂。并且往往合并動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)大血管并發(fā)癥。高血糖是糖尿病的標(biāo)志，也是導(dǎo)致糖尿病慢性血管并發(fā)癥的主要因素。本研究通過觀察在不同葡萄糖濃度狀態(tài)下對培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株凋亡，生存抑制率及形態(tài)學(xué)的改變，從基礎(chǔ)領(lǐng)域方面探討血糖漂移對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害及引發(fā)動脈粥樣硬化機(jī)制。 2型糖尿病的血糖增高，特別是血糖波動對心血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害已被人們證實(shí)。

2、而血管內(nèi)皮細(xì)胞并不只是血管內(nèi)層的屏障，由于它具有分泌功能，所以已被認(rèn)為是最大的內(nèi)分泌器官。近年來研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶-9作為一種降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，能促進(jìn)動脈粥樣硬化(AS)斑塊的形成，發(fā)展及破裂，在AS病變時增高。在葡萄糖濃度波動狀態(tài)下MMP-9表達(dá)情況目前研究報告很少，故本研究通過培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和人髓系白血病單核細(xì)胞株THP-1在葡萄糖濃度波動狀態(tài)下應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)測定MMP-9 mRNA.表達(dá)及蛋白水平的變化，以探求葡萄糖濃

3、度漂移對對血管內(nèi)皮細(xì)胞的MMP-9mRNA表達(dá)及蛋白量變化及其在2型糖尿病大血管病變中的作用。 實(shí)驗(yàn)方法: 1、細(xì)胞培養(yǎng)和計數(shù) 血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304購自中國培養(yǎng)物典藏中心。將凍存的血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304盡快解凍。加入含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液10mL，混勻，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清用培養(yǎng)基稀釋混勻，接種于培養(yǎng)瓶中，直至長滿并融合成單層。用0.125％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液1

4、:1消化，傳代比例為1:2，其他條件不變。取對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞數(shù)分別接種于250ml，50ml培養(yǎng)瓶及6孔，96孔培養(yǎng)板中待細(xì)胞均勻鋪滿容器底面后，分組實(shí)驗(yàn)。 2、實(shí)驗(yàn)分組 將上述培養(yǎng)細(xì)胞更換含1％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，然后分四組：①5mmo l/L葡萄糖組;②20mmol/L甘露醇組；③20mmol/L葡萄糖組；④5mmo l/L葡萄糖和20mmo l/L葡萄糖每24小時交替培養(yǎng)組應(yīng)用無血清培

5、養(yǎng)基37℃5％Co,孵箱中培養(yǎng)14天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3、MTT檢測細(xì)胞存活率 將96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細(xì)胞每孔加入MTT溶液20μl37℃繼續(xù)孵育4小時，然后吸去孔內(nèi)上清液，加入150μlDMSO振蕩10分鐘。選擇490nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值。 4、細(xì)胞凋亡的檢測 應(yīng)用異硫氫酸熒光素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)雙染法檢測細(xì)胞凋亡。PBS沖洗一次后，用1×結(jié)合

6、緩沖液懸浮細(xì)胞至1×106/ml，取100μl細(xì)胞(1×105)稀釋至5ml加入含5μl異硫氫酸熒光素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC/PI)，10μl碘化丙啶(PI)混勻后，避光室溫孵育15min，每管加入400μl，1X結(jié)合緩沖液，并上機(jī)檢測。 5、吖啶橙(Ao)細(xì)胞熒光染色 取6孔培養(yǎng)板中蓋玻片上的已經(jīng)分組按上述方法培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS洗三次，95％乙醇固定20min,1％醋酸作用30sec，加入0.01

7、％AO染色5 min，PBS清洗1min，0.1mmol/L CaCl2分色2min，PBS清洗3次，甘油：PBS1:1封片，熒光顯微鏡下405nm濾光片立即觀察。 6、RT-PCR法檢測的mRNA表達(dá) Trizol提取細(xì)胞總RNA，測OD260/OD28d，計算RNA濃度。取2μgRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取cDNA2μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為12.5μl，94℃預(yù)變性2min，94℃40sec，60℃40sec，7

8、2℃1min共35個循環(huán)，72℃終末延伸5min。取PCR產(chǎn)物5μl電泳分離后進(jìn)行掃描分析，以β-actin條帶亮度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計算其相對表達(dá)量。 7、TGF-βl(ELISA方法)含量檢測 從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，分別將標(biāo)本(標(biāo)準(zhǔn)品)100μl/孔加入，封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育90min。洗板4次，甩凈孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350μl，靜置30sec甩凈，在厚疊吸水紙上拍干。加入生物素化抗體

9、工作液封住反應(yīng)孔37℃孵育60 min，洗板，空白孔外加入酶結(jié)合物工作液(100μl/孔)封住反應(yīng)孔，37℃孵育30min，洗板，加入顯色劑37℃孵育20 min，加入終止液,測OD450值。 8、TGF-βl免疫組化檢測 將上述培養(yǎng)于6孔板中蓋玻片上14天人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用95％乙醇固定過夜，30％過氧化氫水和100％甲醇混合液(1:50)室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗2次，滴加正常山羊血清

10、封閉液，室溫20 min，傾余，不洗，每張片滴加兔抗人TGF-βl多克隆抗體(1:50)4℃過夜；PBS沖洗，加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，20℃孵育20 min，PBS沖洗；滴加鏈霉菌抗生物素一過氧化物酶溶液SABC 20℃20 min，PBS沖洗。DAB顯色15 min，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。 9、Westernblot定量檢測 內(nèi)皮細(xì)胞接種于250ml培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)14天后將細(xì)胞收集。收集的細(xì)胞懸于250

11、μl冰冷緩沖液中將細(xì)胞超聲粉碎，4℃12000g離心60 min，沉淀。吸取上清，考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定樣本中蛋白濃度，然后將每個樣品中蛋白濃度調(diào)至相同。樣品中加入樣品緩沖液，沸水煮5 min，每個樣品取20μl上樣于lO％SDS-PAGE分離，BIO-RAD電泳板，雙板條件為150V，30mA。TTBS洗膜2次，與HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1:5000)室溫孵育2小時。TBS洗膜2次，每次5min，加入顯色液30min，

12、采用Chemin Imager 5500型自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像并對蛋白顯色光密度值IDV進(jìn)行測定和結(jié)果分析。Bax和bc1-2操作方法與其相同。 10、統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)采用-x±s表示。組間差異顯著性比較t檢驗(yàn)。 結(jié)論: 1、持續(xù)性高濃度葡萄糖將隨著葡萄糖濃度的增高呈正相關(guān)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而波動性高葡萄糖將比持續(xù)性高葡萄糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率更高，所以，

13、波動性高葡萄糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害較持續(xù)性高血糖更嚴(yán)重。表示波動性高血糖是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的獨(dú)立危險因子。 2、波動性高葡萄糖比持續(xù)性高葡萄糖更能促進(jìn)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的TGF-βl蛋白分泌及TGF-βl的mRNA表達(dá)。本研究提示波動性高血糖可能通過增加細(xì)胞炎癥因子導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷，增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的。 3、通過與THP-1和EcV304細(xì)胞同時培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：波動性高葡萄糖使血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP-9蛋白含量及MMP-