OPG的血管內(nèi)皮細胞保護作用及機制研究.pdf

1、背景、目的: 動脈粥樣硬化疾病嚴重危害人類健康,其發(fā)病率和死亡率之高一直是頗受世界的關(guān)注?？茖W(xué)家預(yù)測21世紀動脈粥樣硬化性心血管疾病將會成為世界大部分國家引起致殘乃至死亡最主要的因素。血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells,VEC)是鋪陳于心血管內(nèi)壁的一層多功能細胞,在血管通透性屏障、免疫防御及炎性反應(yīng)中起著極其重要的作用。多數(shù)專家認為內(nèi)皮細胞功能障礙和內(nèi)皮完整性喪失是動脈粥樣硬化斑塊形成的前提條件和

2、始動因素。因此,內(nèi)皮功能的研究一直是動脈粥樣硬化生理病理機制探討的熱點。新近研究表明,一種血管形成、增殖和分化過程中起關(guān)鍵性作用的因子-血清骨保護素(OPG)在血管內(nèi)皮功能維持和保護方面起著重要作用。 1997年,Simonet等在測序胎鼠小腸cDNA文庫中時發(fā)現(xiàn)一段序列,它表達的蛋白能明顯抑制破骨細胞的形成,并引起骨密度升高,將其命名為骨保護素(OPG,osteoprotegrin)。此后研究發(fā)現(xiàn)OPG缺乏的小鼠會發(fā)生嚴重的骨

3、質(zhì)疏松和主動脈及腎動脈的中層鈣化,OPG基因的恢復(fù)能預(yù)防骨質(zhì)疏松和血管鈣化。OPG在內(nèi)皮細胞中也一種抗凋亡因子,在早期動脈粥樣硬化的部位可有骨保護素(OPG)的免疫活性。臨床研究也發(fā)現(xiàn),冠心病或外周動脈粥樣硬化疾病患者的OPG水平明顯高于正常人群水平,且隨著粥樣硬化嚴重程度的增高OPG水平也隨之升高。推測OPG與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。 對于OPG內(nèi)皮功能保護和動脈粥樣硬化形成中所起的作用,目前存在著爭議,部分學(xué)者認位O

4、PG促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展；也有人認為動脈粥樣硬化發(fā)生時OPG水平的升高是一種代償性的防御機制,可避免血管進一步受損,起著“血管保護素”的作用。本研究擬從以下幾個方面探討OPG與血管內(nèi)皮和動脈粥樣硬化的關(guān)系,旨在為目前相關(guān)問題的解決提供一些新的可能思路。①OPG對動脈粥樣硬化相關(guān)趨化粘附因子的作用；②OPG對內(nèi)皮細胞抗凋亡作用；③OPG對NF-κB的作用和意義；④冠心病患者外周血OPG水平變化及意義。 方法: 1、體

5、外培養(yǎng)人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),應(yīng)用ELISA法和RT-PCR法檢測不同濃度TNF-α、OPG重組蛋白分別刺激和TNF-α和OPG重組蛋白共同刺激對細胞因子MCP-1、VCAM-1、ICAM-1的影響。 2、體外培養(yǎng)HUVEC,TNF-α、OPG重組蛋白分別刺激和TNF-α和OPG重組蛋白共同刺激HUVEC,分別在0.5h、1h、2h應(yīng)用TIMEL法檢測細胞凋亡占細胞總數(shù)的比例。 3、體外培養(yǎng)HUVEC,通過we

6、stern blotting方法,觀察TNF-α、OPG重組蛋白分別刺激和TNF-α和OPG重組蛋白共同刺激JIVEC后對胞漿蛋白抑制性核轉(zhuǎn)錄因子IκB,以及轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)的NF-κBp65的影響。 4、選擇88例數(shù)據(jù)完整的行冠脈造影檢查者,排除肝腎功能異常、急性心肌梗死發(fā)病<4周、重度心功能衰竭、甲狀腺或腎上腺功能異常者,其中冠狀動脈造影檢查陽性64例為病例組,冠脈造影檢查結(jié)果陰性排除冠心病24例。采用ELISA法檢測64例冠

7、心病患者和24例正常對照者外周血OPG水平；并記錄體重指數(shù)、年齡、吸煙史、高血壓、糖尿病病史,同時檢測血糖、血脂。 結(jié)果: 1、TNF-α(5ng/mL)干預(yù)組炎癥因子MCP1、VCAM1、ICAM1表達升高,明顯高于TNF-α(5ng/mL)和OPG(5ng/mL)共同干預(yù)組、OPG(5ng/mL)干預(yù)組及未干預(yù)組,P<0.01;TNF-α和OPG共同干預(yù)組炎癥因子表達高于OPG干預(yù)組及未干預(yù)組,P<0.05;未干預(yù)組

8、與OPG干預(yù)組炎癥因子表達無統(tǒng)計學(xué)差異。 2、TNF-α(5ng/mL)干預(yù)組凋亡指數(shù)最高,明顯高于TNF-α(5ng/mL)和OPG(5ng/mL)共同干預(yù)組、OPG(5ng/mL)干預(yù)組及未干預(yù)組,P<0.01;TNF-α和OPG共同干預(yù)組凋亡指數(shù)高于OPG干預(yù)組及未干預(yù)組,P<0.05：未干預(yù)組與OPG干預(yù)組炎癥因子表達無統(tǒng)計學(xué)差異。 3、OPG(5ng/mL)干預(yù)組內(nèi)皮細胞胞漿蛋白1κB升高,明顯高于TNF-α(

9、5ng/mL)和OPG(5ng/mL)共同干預(yù)組、TNF-α(5ng/mL)干預(yù)組及未干預(yù)組,P<0.01;TNF-α干預(yù)組IκB明顯降低,明顯低于未干預(yù)組、TNF-α和OPG共同干預(yù)組,P<0.01;TNF-α和OPG共同干預(yù)組與未干預(yù)組IκB表達量未見統(tǒng)計學(xué)差異；OPG干預(yù)組內(nèi)皮細胞核蛋白NF-κBp65明顯降低,低于TNF-α和OPG共同干預(yù)組、TNF-α干預(yù)組及未干預(yù)組,P<0.01;TNF-α干預(yù)組NF-κBp65升高,明顯高

10、于未干預(yù)組、TNF-α和OPG共同干預(yù)組,TNF-α和OPG共同干預(yù)組與未干預(yù)組NF-κBp65表達量未見統(tǒng)計學(xué)差異。 4、冠心病組血清OPG水平(5.16±0.49pmol/L)較正常對照組OPG水平(3.5±0.35pmol/L)明顯上升,P<0.01,OPG水平在不同的狹窄積分分組、冠狀動脈病變血管數(shù)分組中分布有顯著性差異,P<0.01。 結(jié)論: 在內(nèi)皮細胞體外實驗中發(fā)現(xiàn),OPG可以對抗TNF-α刺激引起的