葡萄糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮抑素表達(dá)的影響及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的：2型糖尿病是常見病、多發(fā)病且危害嚴(yán)重，并有不斷上升趨勢。大多數(shù)糖尿病病人的死亡與致殘原因為：大血管動脈粥樣硬化的并發(fā)癥，也即糖尿病大血管并發(fā)癥，包括心、腦血管病及周圍血管病如冠心病、腦卒中、間歇性跛行和下肢壞疽。目前世界范圍內(nèi)糖尿病及其高危人群數(shù)量激增，因此探索糖尿病大血管并發(fā)癥的危險因素并進(jìn)行有效的防治是當(dāng)前一個重大的公共健康課題。 方法： 1、酶聯(lián)免疫吸附實驗法(ELISA)檢測100例2型糖尿病(T2DM)患

2、者(34例T2DM無大血管病變、40例伴發(fā)一種大血管病變、26例伴發(fā)多種大血管病變)和30例健康對照者外周血內(nèi)皮抑素(競爭EIdSA法)、血管內(nèi)皮生長因子VEGF(雙抗體夾心ELISA法)表達(dá)水平的變化，探討內(nèi)皮抑素、VEGF與2型糖尿病大血管并發(fā)癥的關(guān)系。 2、原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分離、培養(yǎng)后，取HUVEC隨機加入不同濃度葡萄糖液中培養(yǎng)，分為正糖對照組(5.6mmol/LGlu)，高糖組(11.2mmol/LGlu、22

3、.4mmol/LGlu組)。分別培養(yǎng)24、48、72、96小時后，收集各組不同作用時間點內(nèi)皮細(xì)胞的總RNA和蛋白，采用RT-PCR法檢測HUVEC中ES mRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測ES蛋白的表達(dá)，分析不同濃度葡萄糖對人內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮抑素在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯水平上的影響，探索高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮抑素的代謝特點。 3、觀察5.6、11.2、22.4mmol/L不同濃度葡萄糖液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞72h時，以wes

4、tern-blot法檢測ES蛋白的表達(dá)、硝酸還原酶法檢測相應(yīng)培養(yǎng)上清液中NO含量變化，分析高糖對NO的產(chǎn)量和內(nèi)皮抑素蛋白表達(dá)的影響；分別應(yīng)用一氧化氮合酶抑制劑L-NAME、一氧化氮供體SNP、鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ干預(yù)高糖(11.2mmol/L，Glu，72h，對照組)作用下的HUVEC，western-blot法檢測各干預(yù)組HUVEC中ES蛋白的變化，探討一氧化氮/環(huán)鳥苷酸(NO/cGMP)信號傳導(dǎo)通路對高糖時人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)內(nèi)

5、皮抑素調(diào)控的可能性。 結(jié)果： 1、內(nèi)皮抑素、VEGF在T2DM大血管病變各組(包括合并一種大血管病變組、合并兩種以上大血管病變組)血清含量分別顯著高于T2DM無大血管病變和健康對照組(內(nèi)皮抑素：(32.4±15.6)ng/ml，(35.1±20.2)ng/ml vs (11.2±8.6)ng/ml，(9.9±6.7)ng/ml；VEGF：(133.5±36.8)pg/ml，(302.1±52.4)pg/ml vs(90.

6、2±42.4)pg/ml，(81.3±33.5)pg/ml，P<0.01)，兩者濃度在健康對照和T2DM無大血管病變組間比較差異不顯著；VEGF在伴發(fā)一種大血管病變、多種大血管病變組間比較表達(dá)水平顯著上調(diào)((133.5±36.8)pg/ml vs (302.1±52.4)pg/ml P<0.01)，而內(nèi)皮抑素的表達(dá)差異不顯著；在T2DM伴發(fā)一種大血管病變組，內(nèi)皮抑素和VEGF成線性正相關(guān)(r=0.540，P<0.01)。 2、1

7、1.2mmol/L葡萄糖組，內(nèi)皮細(xì)胞中ES mRNA和ES蛋白表達(dá)水平隨時間延長而升高，兩者在第72、96h表達(dá)水平顯著高于對照組(P<,72h><0.05，P<,96h><0.01)；22.4mmol/L葡萄糖組，內(nèi)皮細(xì)胞ES mRNA和ES蛋白表達(dá)水平在24、48、72h隨時間延長而增高，于72h時二者的表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，而96h時表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)；對照組中ES mRNA的表達(dá)不隨時間延長

8、而有差異性改變，但ES蛋白的表達(dá)水平隨時間延長出現(xiàn)降低，96h其表達(dá)水平明顯低于24h(P<0.05)3、短時間作用下(72h)，隨葡萄糖濃度升高，HUVEC中：ES蛋白的表達(dá)和上清培養(yǎng)液中NO的含量顯著上調(diào)(與5.6mmol/LGlu組相比，P<0.05)；NO合酶抑制劑L-NAME抑制ES蛋白表達(dá)強度，是對照組(11.2mmol/L,72h)的0.372倍(P<0.01)；鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ抑制ES蛋白表達(dá)強度至對照組的0.4

9、06倍(P<0.01)；一氧化氮供體SNP提高ES蛋白表達(dá)強度，是對照組的1.32倍(P<0.05)。 結(jié)論： 1、內(nèi)皮抑素和VEGF在T2DM大血管病變的發(fā)生、發(fā)展中可能起作用，兩者的變化在一定程度和條件下受自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制的控制，血管生成致動脈粥樣硬化產(chǎn)生是兩種作用相反的細(xì)胞因子間自穩(wěn)態(tài)平衡被打破失衡的結(jié)果。 2、高濃度葡萄糖對HUVEC中ES mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響是雙向的，即短時間內(nèi)起促進(jìn)作用，具時間