飛燕草素葡萄糖苷抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)導(dǎo)致的心腦血管疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，AS已成為西方發(fā)達(dá)國家引起死亡的主要病因，在我國的發(fā)病率也逐年上升。AS發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，Ross提出的氧化損傷一炎性反應(yīng)學(xué)說是目前公認(rèn)的解釋AS發(fā)生機(jī)制的主要假說。該學(xué)說認(rèn)為：血漿氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow density lipoprotein，oxLDL)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。ox

2、LDL主要誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)皮依賴的血管舒張功能下降、血栓形成及炎性損傷。研究證實(shí)，oxLDL與其受體結(jié)合后可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS生成，增加的ROS不僅降低細(xì)胞的抗氧化能力，同時(shí)作為“第二信使”活化下游信號通路，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)屬于促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，通過對細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞參與細(xì)胞對外

3、界刺激的調(diào)節(jié)反應(yīng)。研究表明，增加的ROS能夠促進(jìn)p38MAPK的磷酸化和活化。活化的p38MAPK能夠磷酸化多個(gè)與內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其中，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和炎性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。NF-κB可在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、P-選擇素(P-selectin)、N

4、OX2、p22phox等的表達(dá)。因此，ROS/p38MAPK/NF-κB信號通路在oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中起重要作用，已經(jīng)成為血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)研究的熱點(diǎn)。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn)，自然界中廣泛存在的多種天然活性植物化學(xué)物(phytochemicals)可能對防治AS等慢性代謝性疾病具有重要意義。植物化學(xué)物種類繁多，估計(jì)約6～10萬種，花色苷屬多酚中的黃酮類化合物(flavonoids)，廣泛存在于藍(lán)莓、桑葚、茄子

5、、黑米、紫薯等天然有色植物中。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，法國人攝入的飽和脂肪酸和動物性食物大大高于其他歐美國家，但是AS等心血管疾病的發(fā)病率卻較低，此看似矛盾的現(xiàn)象被稱為“法國悖論(French paradox)”，這主要與法國人經(jīng)常性地消費(fèi)富含花色苷的紅酒有關(guān)。人群干預(yù)研究表明，每天攝入600 mg花色苷，能顯著增加血漿總抗氧化度，減少炎性介質(zhì)產(chǎn)生，降低AS和冠心病的發(fā)病率。目前自然界中已發(fā)現(xiàn)500多種不同結(jié)構(gòu)的花色苷，本實(shí)驗(yàn)室前期對21種常

6、見的結(jié)構(gòu)類似、成分單一的花色苷單體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)效應(yīng)關(guān)系分析，初步明確了與花色苷抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)特征，并篩選出了抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用顯著的花色苷--飛燕草素葡萄糖苷(delphinidin-3-glucoside，DPg)。本課題旨在前期研究基礎(chǔ)上，深入探索飛燕草素葡萄糖苷抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的分子機(jī)制。本研究首先在體外構(gòu)建了oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙模型，觀察oxLDL對細(xì)胞活力，氧化損傷標(biāo)志物L(fēng)D

7、H、MDA、NO、sICAM-1表達(dá)和SOD酶活力，細(xì)胞內(nèi)ROS生成以及細(xì)胞凋亡等的影響。并進(jìn)一步觀察不同濃度的飛燕草素葡萄糖苷對內(nèi)皮細(xì)胞活力、氧化損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、MDA、ET-1、NO表達(dá)和SOD酶活力，細(xì)胞凋亡以及單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附等的影響。在機(jī)制研究中，通過qRT-PCR、Western blot、雙熒光素酶報(bào)告基因以及加入特異性抑制劑干預(yù)等實(shí)驗(yàn)方法，探索ROS/p38MAPK/NF-κB信號通路在飛燕草素葡萄糖苷抑制內(nèi)皮細(xì)

8、胞功能障礙中的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1)oxLDL能明顯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，主要表現(xiàn)為顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生、增加脂質(zhì)過氧化和炎性反應(yīng)、降低細(xì)胞抗氧化能力、抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能以及增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　 (2)DPg能明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，主要表現(xiàn)為顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡、減少脂質(zhì)過氧化和炎性反應(yīng)、提高細(xì)胞抗氧化能力、促進(jìn)內(nèi)皮

9、細(xì)胞分泌功能以及抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附。
　　 (3)ROS/p38MAPK/NF-κB信號通路在DPg抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DPg能明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的ROS生成、NADPH氧化酶亞基Nox2和p22phox表達(dá)、p38MAPK磷酸化以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的活性及表達(dá)。
　　 綜上所述，飛燕草素葡萄糖苷在對內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有明顯的抑制作用，并可能主要通過ROS/p38