高濃度游離脂肪酸在不同濃度葡萄糖協(xié)同作用下誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡及胰島素抵抗的分子機(jī)制.pdf

1、本文通過對不同濃度葡萄糖和高濃度游離脂肪酸協(xié)同作用一定時(shí)間的β細(xì)胞的胰島素基因表達(dá)及分泌功能的檢測，β細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測及凋亡相關(guān)基因表達(dá)來觀察β細(xì)胞功能障礙的表現(xiàn)模式。并進(jìn)一步對功能受損的β細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，通過觀察游離脂肪酸在不同濃度葡萄糖協(xié)同作用下對PI-3K、P-PKB、PDX-1活性及表達(dá)的影響來揭示這種協(xié)同作用導(dǎo)致β細(xì)胞功能損傷的分子機(jī)制。 研究方法： wistar大鼠胰島β細(xì)胞原代培養(yǎng)及β細(xì)胞功能損

2、傷模型的建立采用明尼蘇達(dá)大學(xué)改良方法，原位灌注消化、梯度密度離心分離純化胰島。經(jīng)DTZ特異染色鑒定并過夜孵育后，將細(xì)胞分為九組：分別給予A組：5.5mMGlucose：B組：5.5mM Glucose，0.4mM PA；C組：5.5mM Glucose，0.4fnM 0A；D組：11mM Glucose；E組：11mM Glucose，0.4mM PA；F組：11mM Glucose，0.4mM0A：G組：25mM Glucose：H組

3、：25mM Glucose，0.4mM PA：Ⅰ組：25mM Glucose，0.4mM 0A：的系列濃度孵育，在孵育24h、48h后，各取一組細(xì)胞(n=6)用放免法測定在16.7mM葡萄糖刺激后1h時(shí)培養(yǎng)液上清中的胰島素含量。用半定量RT-PCR檢測上述七組細(xì)胞在16.7mM葡萄糖刺激后5min的細(xì)胞內(nèi)胰島素mRNA水平(n=6)。 利用western技術(shù)檢測上述九組細(xì)胞24h、48h時(shí)PI-3K的p85亞單位的蛋白含量以及磷

4、酸化的PKB的蛋白含量(n=4)。半定量RT-PCR檢測九組細(xì)胞24h、48h時(shí)bax、myc以及PDX-1的mRNA表達(dá)量(n=6)。 western免疫印跡分析檢測PDX-1的蛋白表達(dá)量(n=4)。間接免疫熒光染色顯示PDX-1在不同狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的原位表達(dá)。 研究結(jié)果： 胰島細(xì)胞收獲量、純度及成活率分別為438±27個(gè)胰島/胰腺；87.68±3.2％；92.3±2.3％。 胰島細(xì)胞的胰島素分泌功能：培養(yǎng)的胰島

5、細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下和16.7mM的葡萄糖刺激1h后胰島素分泌量為39.74±2.73mM，128.94±8.72mM：SI為3.25±0.26，說明胰島功能良好。 經(jīng)不同糖和游離脂肪酸糖濃度孵育后實(shí)驗(yàn)組胰島細(xì)胞在16．7mM的葡萄糖1h后的胰島素分泌量：在培養(yǎng)24h后，對照組兩個(gè)時(shí)相分泌量在高濃度組(G組)有增高趨勢，組間無明顯差別(p>0.05)：在油酸存在時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增高，基礎(chǔ)時(shí)相分泌量組間比較無明顯差別，刺激相分泌量

6、有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：在軟脂酸存在時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增高，基礎(chǔ)分泌量及刺激后分泌量均明顯下降(p<0.01)。在培養(yǎng)48h后不同葡萄糖濃度孵育的兩個(gè)時(shí)相分泌量組間無明顯差別(p>0.05)；在油酸存在時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增高，兩個(gè)時(shí)相分泌量組間比較均有下降(p<0.05)：在軟脂酸存在時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增高，兩個(gè)時(shí)相的分泌量組間比較下降更明顯(p<0.01)。同一濃度葡萄糖水平時(shí)，在培養(yǎng)24h后油酸組兩時(shí)向下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

7、>0.05)；軟脂酸組兩時(shí)向均明顯下降(p<0.01)。在培養(yǎng)48h后油酸組刺激后時(shí)相分泌量減少(p<0.05)：軟脂酸組兩時(shí)向差別顯著(p<0.01)各組細(xì)胞在16.7mM葡萄糖刺激5min時(shí)的胰島素mRNA表達(dá)：在培養(yǎng)24h及48h后，葡萄糖對照組胰島素mRNA表達(dá)組間無明顯差別(p>0.05)：油酸組培養(yǎng)24h胰島素mRNA表達(dá)組間無明顯差別(p>0.05)，培養(yǎng)48h后mRNA表達(dá)(C、I)組間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)

8、；軟脂酸組培養(yǎng)24h時(shí)胰島素mRNA表達(dá)量下降(p<0.05)，培養(yǎng)48h后胰島素mRNA表達(dá)量下降明顯(p<0.01)。 各組細(xì)胞在不同時(shí)間凋亡的原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUUNEL)檢測：在培養(yǎng)24h及48h后，葡萄糖對照組胰島細(xì)胞凋亡數(shù)量無明顯差異(p>0.05)，油酸組培養(yǎng)24h凋亡細(xì)胞數(shù)略有增加，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，48h凋亡細(xì)胞數(shù)組間比較C組、H組與工組存在差異(p<0.05)，軟脂酸組24h細(xì)胞即出現(xiàn)明顯的凋亡，組

9、間比較均存在差異(p<0.05)。48h后凋亡更加明顯，組間比較均存在差異(p<0.01)。各組細(xì)胞在不同時(shí)間凋亡相關(guān)基因bax、myc的mRNA表達(dá)：在培養(yǎng)24h及48h后，葡萄糖對照組bax的mRNA幾乎不表達(dá)，油酸組少量表達(dá)，組間無明顯差別(p>0.05)，軟脂酸組培養(yǎng)24h時(shí)bax的mRNA表達(dá)量上升(p<0.05)，培養(yǎng)48h后baX mRNA表達(dá)量增加明顯(p<0.01)。葡萄糖對照組培養(yǎng)24h及48h后及油酸組24h時(shí)my

10、c的mRNA表達(dá)組間無明顯差別(p>0.05)，油酸組48h時(shí)myc mRNA表達(dá)開始下降(p<0.05)，軟脂酸組培養(yǎng)24h時(shí)myc的mRNA表達(dá)量下降(p<0.05)，培養(yǎng)48h后myc的mRNA表達(dá)量下降明顯(p<0.01)。 各組細(xì)胞在不同時(shí)間P13K、磷酸化PKB/Akt、PDX-1蛋白的表達(dá)：在培養(yǎng)24h及48h后，葡萄糖對照組組間無明顯差別(p>0.05)，油酸組隨時(shí)間的延長及葡萄糖濃度的增高P13K、磷酸化PKB

11、/Akt及PDX-1蛋白的表達(dá)有下降趨勢，組間比較48h時(shí)C組與Ⅰ組存在差異(p<0.05)，軟脂酸組隨時(shí)間的延長及葡萄糖濃度的增高P13K、磷酸化PKB/Akt及PDX-1蛋白的表達(dá)明顯下降，組間比較均存在明顯差異(p<0.01)。 各組細(xì)胞在不同時(shí)間PDX-1基因mRNA水平的表達(dá)：A、D、G組培養(yǎng)24h及48h的PDX-1基因mRNA水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，B、E、H組培養(yǎng)24h的PDX-1基因mRNA表達(dá)減少

12、，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，48h的N/C值組間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(p<0.01)。C、F、I組培養(yǎng)24h的PDX-1基因mRNA水平有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，48h的PDX-1基因mRNA水平組間比較C組與I組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。 各組細(xì)胞在不同時(shí)間PDX-1蛋白的核轉(zhuǎn)位表達(dá)：細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24h及48h后，對照組在基礎(chǔ)狀態(tài)下均在胞漿內(nèi)有少量表達(dá)，葡萄糖刺激后幾乎全部在核內(nèi)表達(dá)

13、。為量化這種核轉(zhuǎn)位程度，每組計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞并分別記數(shù)有熒光信號在核內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞數(shù)N及熒光信號在核周圍表達(dá)的細(xì)胞核數(shù)C，比較各組的N/C值。結(jié)果為：A、D、G組培養(yǎng)24h及48h的N/C值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，B、E、H組培養(yǎng)24h的N/C值減少，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，48h的N/C值組間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(p<0.01)。C、F、I組培養(yǎng)24h的N/C值下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，48h的N/C值組間

14、比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。 研究結(jié)論： 高濃度游離脂肪酸培養(yǎng)可使β細(xì)胞的功能受損，表現(xiàn)為基礎(chǔ)胰島素水平分泌降低，葡萄糖刺激后胰島素的合成及分泌能力下降。導(dǎo)致β細(xì)胞的葡萄糖刺激后的胰島素基因表達(dá)減少，這種損傷隨葡萄糖濃度升高和時(shí)間的延長而加重。 高濃度游離脂肪酸使β細(xì)胞出現(xiàn)胰島素的合成功能損害，同時(shí)亦發(fā)生胰島素的分泌功能障礙。在同一濃度水平上，飽和脂肪酸對胰島細(xì)胞功能的損傷大于不飽和脂肪酸，并且這種損傷隨

15、著葡萄糖濃度增高和時(shí)間延長而加重。 高濃度軟脂酸可通過抑制P13K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而降低磷酸化PKB/Akt、PDX-1蛋白的表達(dá)引起胰島細(xì)胞自身的胰島素抵抗，這種損傷作用隨葡萄糖濃度增高而加強(qiáng)。在同一濃度水平上飽和脂肪酸(軟脂酸)對P13K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的抑制明顯大于不飽和脂肪酸(油酸)，提示對β細(xì)胞“脂毒性”而言飽和脂肪酸大于不飽和脂肪酸。 高濃度軟脂酸可通過抑制P13K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)，使之抗凋亡作用減弱，進(jìn)